【摘 要】
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[目 的]应用液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-tandem massspectrometry,LC-MS/MS）技术对肾结石患者和健康人血清样本进行脂质组学分析,探讨可能与肾结石形成相关的活性脂质成分,以期发现其与肾结石形成有关的潜在因素。[方法]纳入2021年3月1日至2021年9月30日期间于我院确诊为肾结石的31例患者为实验组和志愿招募的40例健康人为对照组。
【基金项目】
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国家自然科学基金No.82060137；
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[目 的]应用液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-tandem massspectrometry,LC-MS/MS）技术对肾结石患者和健康人血清样本进行脂质组学分析,探讨可能与肾结石形成相关的活性脂质成分,以期发现其与肾结石形成有关的潜在因素。[方法]纳入2021年3月1日至2021年9月30日期间于我院确诊为肾结石的31例患者为实验组和志愿招募的40例健康人为对照组。收集71例受试者的血清和临床资料。对收集的血清样本进行复融、离心、干燥、重组等预处理,获得脂质检测前生物样品;应用LC-MS/MS的脂质组学技术测定其血清中脂质成分并定量分析每种脂质成分的表达水平,结合人类代谢组学数据库（humanmetabonomics database,HMDA）和标准品对照来鉴定脂质代谢物,结果以聚类热图展示。对检测结果进行主成分分析（principal component analysis,PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA）找出实验组和对照组血清中的差异脂质介质;再利用差异性代谢绘制受试特征工作曲线（receiver operating characteristic,ROC）,进一步找出可能用于区分肾结石患者和健康人血清中的脂质介质;最后,对差异性代谢物的代谢通路、生物学作用及代谢物前体等进行聚类热图分析,找出主要代谢物通路和生物学特性。为验证上述质谱结果,利用火山图对肾结石患者和健康人血清中有统计学差异的二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）代谢物进行分析;再次取31例肾结石患者和40例健康人的血清,处理方法同前,利用LC-MS/MS技术对31例肾结石患者和40例健康人血清中DHA的代谢物进行定量检测,所得结果与上述质谱结果对比,从而检验上述检测结果是否可靠。[结果]纳入本研究的71例受试者中,其年龄在29～83岁间,平均年龄56.257±11.737岁,男37例,女34例。LC-MS/MS检测结果显示,71例受试者血清中共检测出45种有生物活性脂质介质;其中由ω-3簇多不饱和脂肪酸（polyunsaturated patty acids,PUFA）的代谢产物18种,包括二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid,EPA）,ω-6 簇 PUFA 的代谢产物 27 种,包括花生四烯酸（arachidonicacid,AA）和亚油酸（linoleic acid,LA）;聚类热图分析可见实验组和对照组的血清中存在不同的脂质介质且每种脂质介质的表达水平存在差异。主成分分析结果显示,肾结石患者和健康人血清脂质介质的表达水平存在明显差异。通过OPLS-DA判别分析和t检验,在实验组和对照组间共鉴定出有显著差异脂质介质29种（P＜0.05）。利用差异性代谢物绘制ROC 曲线图,发现 8-HETE、20-HETE、12-HETE、12-HEPE、14-HDHA 等 5 种差异代谢物的曲线下面积大于0.8,可见这5种差异代谢物在区分肾结石患者和健康人方面有较好准确性。同时,对差异性代谢物的代谢通路、生物学作用及代谢物前体等进行聚类热图分析结果显示,由环氧化酶（cyclooxygenases,COX）途径产的脂质介质2种,脂氧合酶（lipoxygenases,LOX）途径产生的脂质介质22 种,细胞色素 P450 环氧化酶（cytochrome P450 epoxygenases,CYP450）途径产生的脂质介质3种,非酶代谢途径产生的脂质介质2种;AA和LA代谢物中促炎的有19种,DHA和EPA代谢物中抗炎的有7种;热图可清楚看出29种差异性代谢中 8-HETE、12-HETE、20-HETE、14-HDHA 和 12-HEPE 在肾结石患者血清中的表达量高,在健康人血清中的表达量低,可明显的区分肾结石患者和健康人。最后,验证上述LC-MS/MS结果可靠性;利用火山图对DHA代谢物进行分析,其结果与上述热图分析结果一致;再次利用LC-MS/MS对71例受试者血清中的DHA代谢物进行定量验证分析进一步验证质谱结果,其结果与质谱结果一致。[结论]基于LC-MS/MS技术的脂质组学是研究肾结石疾病血清中脂质代谢物的可靠方法,可为研究人体脂质相关代谢性疾病在肾结石发生发展中的作用提供一种新方法。本研究发现肾结石患者和健康人血清中有生物活性的脂质介质45种,其中有差异的脂质介质29种,同时发现血清中8-HETE、20-HETE、12-HETE、12-HEPE、14-HDHA这5种脂质介质能较好的区分肾结石和健康人,为肾结石形成的早期预测提供了新的思路。
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