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钩端螺旋体(简称钩体)病是全球流行的重要人兽共患病。钩体感染鼠类等宿主动物后常无症状出现且长期经尿液排菌,污染水源或土壤形成传染源,人接触污染了钩体的疫水或疫土后均发病,严重者可出现肝脏、肾脏等组织的炎症性损伤。新近发现,钩体感染人和不同动物宿主后引起的炎症反应程度明显不同,这与机体组织损伤及病原体的清除密切相关,但其机制不明。众所周知,单核-巨噬细胞是最主要的巨噬细胞,有文献报道,单核-巨噬细胞能吞噬钩体,并杀灭钩体,钩体感染机体后肺和肾脏等主要炎症性损伤器官中发现有单核-巨噬细胞侵润。而一些研究发现NLRP3(NOD样受体蛋白3)炎症小体与病原菌诱导宿主细胞产生炎症反应密切相关。但是钩体感染宿主巨噬细胞后能否激活NLRP3炎症小体并且参与炎症反应及其机制尚不清楚。本研究以THP-1(人单核细胞株)和MPM(小鼠原代腹腔巨噬细胞)为模型,探究人和小鼠巨噬细胞吞噬钩体后对NLRP3炎症小体活化的影响及NLRP3炎症小体活化途径,进而深入探索钩体致病机制,为钩体病防治提供科学依据。1.问号钩体感染巨噬细胞NLRP3炎症小体活化检测及其对炎性细胞因子释放的影响(1)问号钩体感染巨噬细胞模型的建立:用MOI 100(问号钩体数目与细胞数目比例为100:1)的问号钩体感染THP-1和MPM细胞于37℃5%CO2条件下分别培养1 h、2 h、4 h、12 h、24 h,建立细胞模型;此外,在THP-1和MPM细胞中转染NLPR3炎症小体基因沉默序列或添加NLRP3特异性阻断剂glybenclamide(格列本脲)和Caspase-1(半胱氨酸蛋白酶-1)特异性阻断剂Z-YVAD-FMK预处理30 min后再感染问号钩体建立基因沉默细胞和阻断细胞感染模型;同时设置不感染问号钩体的正常细胞为对照组细胞。(2)NLRP3 mRNA水平检测结果:选用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)和β-actin(β-肌动蛋白)分别作为THP-1和MPM细胞的内参,用TRIzol法提取细胞总mRNA,随后逆转录成c DNA,采用实时荧光定量RT-PCR检测感染组和对照组THP-1和MPM细胞中NLRP3 mRNA水平,以确定NLRP3炎症小体是否表达。结果显示,问号钩体感染THP-1细胞NLRP3 mRNA表达水平在1 h后上调至感染前的4.05倍(P<0.05),2 h、4 h和12 h分别下调至感染前的0.34、0.33和0.06倍(P<0.05),感染24 h后上调至感染前的1.66倍。MPM细胞中NLRP3 mRNA表达水平在1 h、2 h、4 h和12 h后分别上调至感染前对照细胞的9.42、17.08、28.12和4.65倍(P<0.05),感染24 h后下调至感染前的0.17倍(P<0.05)。(3)NLRP3蛋白表达水平检测结果:应用流式细胞术检测感染组和对照组THP-1和MPM细胞NLRP3蛋白水平,以确定NLRP3炎症小体是否表达。结果表明,问号钩体感染THP-1细胞NLRP3蛋白表达率分别从感染前的9.26%上升至94.01%、89.24%、31.80%、19.74%和11.28%(P<0.05),MPM细胞NLRP3蛋白表达率分别从感染前的18.71%上升至58.78%、43.64%、36.42%、76.46%和85.21%(P<0.05)。(4)NLRP3抑制剂对问号钩体诱导巨噬细胞炎性细胞因子分泌的影响:采用ELISA(酶联免疫吸附试验)细胞因子定量检测试剂盒,结合NLRP3阻断实验,定量检测感染组、阻断组和对照组THP-1和MPM细胞NLRP3炎症小体特征性细胞因子IL-1β、IL-18和IL-33分泌水平,以确定NLRP3炎症小体活化与否。结果显示,IL-1β在THP-1和MPM细胞感染1 h后出现上升,NLRP3抑制剂阻断后阻断后THP-1细胞IL-1β下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.004、0.01、0.006、0.02和0.007倍(P<0.05),MPM细胞IL-1β下降至未阻断细胞感染相同时间段的未阻断细胞感染相同时间段的0.14、0.12、0.007、0.22和0.009倍(P<0.05);IL-18在THP-1和MPM细胞感染1 h出现上升,NLRP3抑制剂阻断后,THP-1细胞中IL-18下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.07、0.06、0.06、0.37和0.39倍(P<0.05),MPM细胞IL-18下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.30、0.11、0.19、0.28和0.40倍(P<0.05);IL-33在THP-1和MPM细胞感染问号钩体12 h后出现上升,NLRP3抑制剂阻断后,THP-1细胞中IL-33下降至是未阻断细胞感染相同时间段的0.59和0.60倍(P<0.05),MPM细胞中IL-33下降至是未阻断细胞感染相同时间段的0.30和0.28倍(P<0.05)。问号钩体感染引起的THP-1和MPM细胞IL-1β、IL-18和IL-33分泌水平升高,且均能被NLRP3特异性阻断剂有效阻断(P<0.05)。(5)NLRP3基因沉默对问号钩体诱导巨噬细胞炎性细胞因子分泌的影响:采用ELISA细胞因子定量检测NLRP3基因沉默细胞中NLRP3炎症小体特征性细胞因子IL-1β、IL-18和IL-33的分泌水平,以了解NLRP3炎症小体引起问号钩体感染巨噬细胞释放炎性细胞因子水平。结果显示,转染NLRP3基因沉默序列后THP-1细胞IL-1β下降至未转染细胞感染相同时间段的0.03、0.02、0.04、0.02和0.02倍(P<0.05),MPM细胞IL-1β下降至未转染细胞感染相同时间段的0.12、0.17、0.11、0.98和0.23倍(P<0.05);THP-1细胞IL-18下降至是未转染细胞感染相同时间段的0.60、0.31、0.56、0.22和0.68倍(P<0.05),MPM细胞IL-18下降至未转染细胞感染相同时间段的0.21、0.17、0.18、0.13和0.12倍(P<0.05);THP-1细胞转染NLRP3基因沉默序列后12 h和24 h后IL-33分泌水平下降至未转染细胞感染相同时间段的0.42和0.42倍(P<0.05),MPM细胞IL-33下降至未转染细胞感染相同时间段的0.19和0.22倍(P<0.05)。转染NLRP3基因沉默序列后THP-1和MPM细胞IL-1β、IL-18和IL-33表达水平均显著下调(P<0.05)。(6)Caspase-1抑制剂对问号钩体诱导巨噬细胞分泌炎性细胞因子的影响:采用ELISA技术结合Caspase-1(半胱氨酸蛋白酶-1)阻断剂Z-WEHD-FMK抑制实验检测感染组、阻断组和对照组THP-1和MPM细胞因子IL-1β、IL-18和IL-33的分泌水平,了解NLRP3炎症小体引起问号钩体感染巨噬细胞分泌炎性细胞因子水平。结果显示,THP-1和MPM细胞IL-1β在感染钩体后在1 h后出现上升,Z-WEHD-FMK抑制剂阻断后,THP-1细胞IL-1β下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.51、0.38、0.37、0.43和0.59倍(P<0.05),MPM细胞IL-1β下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.17、0.14、0.07、0.26和0.12倍(P<0.05);IL-18在THP-1和MPM细胞感染问号钩体1 h后出现上升,Z-WEHD-FMK抑制剂阻断后,THP-1细胞IL-18下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.70、1.29、0.57、0.71和0.89倍(P<0.05),MPM细胞IL-18下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.30、0.42、0.78、0.28和0.60倍(P<0.05);IL-33在THP-1和MPM细胞感染问号钩体12 h后出现上升,Z-WEHD-FMK抑制剂阻断后,THP-1细胞IL-33下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.70和0.68倍(P<0.05),MPM细胞IL-33下降至未阻断细胞感染相同时间段0.35和0.47倍(P<0.05)。Caspase-1特异性阻断剂Z-WEHD-FMK能够有效阻断问号钩体诱导炎性细胞因子IL-1β、IL-18和IL-33的表达水平(P<0.05)。2.ROS和溶酶体途径对问号钩体感染巨噬细胞NLRP3炎症小体活化的影响(1)问号钩体感染巨噬细胞模型的建立:用MOI为100:1(问号钩体数目与细胞数目比例为100:1)的问号钩体感染THP-1和MPM细胞于37℃5%CO2条件下分别培养1 h、2 h、4 h、12 h和24 h建立细胞感染模型;添加NADPH(还原型辅酶II)特异性抑制剂香荚兰乙酮(apocynin)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)特异性清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和蛋白酶B(cathepsin B)特异性阻断剂CA-074me至THP-1和MPM细胞预处理30 min后感染问号钩体1h、2h、4h、12h和24h,此为阻断细胞组建立阻断细胞感染模型;同时设置不感染问号钩体的正常细胞为对照组细胞。(2)问号钩体感染巨噬细胞ROS水平检测结果:香荚兰乙酮(apocynin)为NADPH特异性抑制剂,故采用ROS特异性荧光探针DCFH-DA(二氯荧光黄)标记后,运用荧光显微镜观察,结合NADPH特异性抑制剂香荚兰乙酮阻断实验检测感染组、阻断组和对照组THP-1和MPM细胞NADH/NADPH及ROS水平,以确定ROS来源。结果显示,感染问号钩体后,MPM细胞ROS特异荧光亮度较未感染细胞逐渐增强,4 h时达到最强;NADPH阻断后组各时间段细胞荧光亮度相对同一时间段未阻断感染细胞株明显,而THP-1细胞感染钩体后ROS特异荧光亮度变化不如MPM细胞明显,ROS荧光亮度均能被阻断剂所抑制而减弱。(3)ROS清除剂对问号钩体诱导巨噬细胞分泌炎性细胞因子分泌水平的影响:N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是经典的ROS清除剂,故采用ELISA试剂盒,结合NAC清除剂阻断实验检测感染组、阻断组和对照组THP-1和MPM细胞IL-1β、IL-18和IL-33表达水平情况,以确定或排除ROS途径激活NLRP3炎症小体的作用。结果显示,THP-1和MPM细胞IL-1β在感染钩体1 h后出现上升,NAC阻断细胞后,THP-1细胞IL-1β下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.03、0.03、0.07、0.07和0.02倍(P<0.05),MPM细胞IL-1β下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.12、0.11、0.02、0.02和0.03倍(P<0.05);THP-1和MPM细胞IL-18在感染问号钩体1 h后出现上升,NAC阻断细胞后,THP-1细胞IL-18下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.33、0.42、0.03、0.36和0.47倍(P<0.05),MPM细胞IL-18下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.24、0.24、0.10、0.18和0.14倍(P<0.05);IL-33在THP-1和MPM细胞感染问号钩体12 h后出现上升,NAC阻断细胞后,THP-1细胞IL-33下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.81和0.71倍(P<0.05),MPM细胞IL-33下降至是未阻断细胞感染相同时间段的0.39和0.47倍(P<0.05),阻断后细胞IL-1β、IL-18和IL-33分泌显著下调(P<0.05)。ROS特异性清除剂NAC能够有效地抑制炎性细胞因子IL-1β、IL-18和IL-33的表达水平。(4)组织蛋白酶B抑制剂对问号钩体诱导巨噬细胞分泌炎性细胞因子分泌水平的影响:CA-074me是蛋白酶B(cathepsin B)抑制剂,故采用ELISA结合蛋白酶B阻断实验检测感染组、阻断组和对照组THP-1和MPM细胞IL-1β、IL-18、IL-33表达水平情况,以确定或排除溶酶体途径在激活NLRP3炎症小体中的作用。结果显示,CA-074me存在的情况下,IL-1β在THP-1和MPM细胞感染问号钩体1h后出现上升,CA-074me抑制剂阻断后,THP-1细胞IL-1β下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.15、0.19、0.25、0.17和0.16倍(P<0.05),MPM细胞IL-1β下降至是未阻断细胞感染相同时间段的0.06、0.01、0.02、0.06和0.03倍(P<0.05);IL-18在THP-1和MPM细胞感染问号钩体1 h后出现上升,CA-074me抑制剂阻断后,THP-1细胞IL-18下降至是未阻断细胞感染相同时间段的0.20、0.26、0.35、0.33和0.42倍(P<0.05),MPM细胞IL-18下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.27、0.22、0.20、0.18和0.14倍(P<0.05);IL-33在THP-1和MPM细胞感染问号钩体12 h后出现上升,CA-074me抑制剂阻断后,THP-1细胞中IL-33下降至未阻断细胞感染相同时间段的0.84和0.85倍(P<0.05),MPM细胞中IL-33下降至是未阻断细胞感染相同时间段的0.21和0.22倍(P<0.05)。蛋白酶B特异性阻断剂CA-074me能够有效地阻断炎性细胞因子IL-1β、IL-18和IL-33的分泌水平。研究结论:1.问号钩体感染THP-1和MPM细胞后,NLRP3 mRNA和蛋白水平总体趋势均有显著上调,NLRP3炎症小体特征性炎性细胞因子IL-1β、IL-18和IL-33分泌水平均显著上调,NLRP3和Caspase-1阻断,以及NLRP3基因沉默后IL-1β、IL-18和IL-33分泌水平均显著下调,提示问号钩体感染人和小鼠巨噬细胞后激活NLRP3炎症小体并诱发炎症反应。此外,IL-1β在人巨噬细胞中分泌水平较小鼠巨噬细胞分泌水平高,且分泌时间较小鼠巨噬细胞早,IL-18和IL-33在人和小鼠巨噬细胞中分泌水平较低,提示不同宿主来源巨噬细胞感染钩体后细胞因子分泌规律存在明显差异。研究结果揭示了问号钩体诱导不同宿主巨噬细胞产生炎症反应不同,具有较高的创新性和重要的学术价值。2.问号钩体感染THP-1和MPM细胞后ROS水平均有显著上升,且以感染的小鼠巨噬细胞上调更为显著,ROS途径和溶酶体途径阻断后,NLRP3特征性炎症因子IL-1β、IL-18和IL-33均出现显著下调,提示ROS途径和溶酶体途径均参与了NLRP3炎症小体的活化,研究结果为揭示问号钩体感染激活NLRP3炎症小体的机制提供了依据,具有较高的创新性和重要的学术价值。