【摘 要】
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肝细胞癌（HCC）是世界上第三大癌症相关死亡原因,在慢性肝病患者中发病率较高,五年存活率较低。对于早期患者,临床上以手术切除疗效最为显著,而中晚期多采用放疗、化疗和免疫治疗等手段。大部分肝细胞癌患者在确诊时已处于中、晚期,不适用手术切除,索拉菲尼作为晚期HCC的主要化疗药物,能显著延长HCC患者的生存时间。然而,经过一段时间的索拉菲尼治疗之后通常会出现化疗耐药,这也是肝细胞癌患者预后差的一个重要因
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肝细胞癌（HCC）是世界上第三大癌症相关死亡原因,在慢性肝病患者中发病率较高,五年存活率较低。对于早期患者,临床上以手术切除疗效最为显著,而中晚期多采用放疗、化疗和免疫治疗等手段。大部分肝细胞癌患者在确诊时已处于中、晚期,不适用手术切除,索拉菲尼作为晚期HCC的主要化疗药物,能显著延长HCC患者的生存时间。然而,经过一段时间的索拉菲尼治疗之后通常会出现化疗耐药,这也是肝细胞癌患者预后差的一个重要因素。如今,越来越多的报道发现长链非编码RNA（lncRNA）参与肿瘤的进展和耐药。为了鉴定肝细胞癌索拉菲尼耐药的治疗靶点,本课题通过全转录组测序建立HCC索拉菲尼耐药细胞的差异基因表达谱,并筛选出差异表达的关键lncRNA,最后对其作用机制进行初步探究。本课题首先建立了HCC索拉菲尼耐药细胞Huh7-S和SMMC7721-S,并对Huh7-S细胞和其亲代Huh7细胞进行了全转录组测序,经过初步筛选,共得到578个差异表达的lncRNA,其中上调基因311个,下调基因267个;70个差异表达的mRNA,其中上调基因43个,下调基因27个。在差异表达的lncRNA中,LINC00540在两种索拉菲尼耐药细胞中表达均显著上调,且LINC00540高表达与HCC患者的不良预后显著相关,因此以LINC00540作为进一步机制研究的候选lncRNA。其次,通过lncRNA-mRNA共表达分析发现AKR1C2可能是LINC00540的一个靶基因,并且AKR1C2在Huh7-S和SMMC7721-S细胞中均显著高表达。在Huh7-S和SMMC7721-S细胞中对LINC00540进行了敲低,CCK-8实验显示HCC细胞对索拉菲尼的敏感性增强;通过transwell和划痕实验检测发现Huh7-S和SMMC7721-S细胞的迁移和侵袭能力下降;通过Western blotting实验检测EMT过程中关键蛋白的表达,发现敲低LINC00540后EMT过程受到抑制;又通过流式细胞术检测到索拉菲尼诱导下的细胞凋亡增加。随后在Huh7和SMMC7721细胞中对LINC00540进行了过表达,通过以上实验检测,结果显示HCC细胞对索拉菲尼的敏感性降低,促进了细胞的迁移、侵袭和EMT,同时索拉菲尼诱导下的细胞凋亡减少。为了进一步探究LINC00540的作用机制,借助生物信息学预测发现miR-4677-3p与LINC00540和AKR1C2有相互作用,通过Western bloting和qRT-PCR实验间接验证了AKR1C2为LINC00540和miR-4677-3p的靶基因,通过双荧光素酶报告基因验证了miR-4677-3p能够与LINC00540和AKR1C2直接相互作用。通过回复实验发现,LINC00540可以通过miR-4677-3p/AKR1C2轴发挥调控作用。接下来在Huh7-S和SMMC7721-S细胞中沉默AKR1C2,再次通过实验验证,结果发现HCC细胞对索拉菲尼的敏感性增强,抑制了细胞的迁移、侵袭和EMT,促进了细胞的凋亡。由此得出,LINC00540作为竞争性内源RNA（ceRNA）,通过竞争性结合miR-4677-3p来促进AKR1C2的表达,从而增强HCC细胞索拉菲尼耐药、迁移、侵袭、EMT和抑制凋亡。综上,LINC00540在HCC细胞中发挥着原癌基因的作用,并通过竞争性结合miR-4677-3p正向调控AKR1C2,LINC00540可能成为HCC患者经索拉非尼治疗后潜在的预后标志物和耐药治疗的分子靶点。
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