苦地胆内酯对嗜水气单胞菌感染斑马鱼的保护效果及其机理初探

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苦地胆(Elephantopus scaber Linn.)是一种分布广泛、来源丰富的民间常用传统中草药。苦地胆内酯(E. scaber lactones,ESL)作为苦地胆的重要活性成分,对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、巴氏杆菌、蜡状芽孢杆菌等具有明显的体外抗菌作用;对供试细菌的体外抗菌作用机理主要是在细菌的对数生长期,破坏细菌细胞壁,改变细胞膜通透性,导致细胞组分丧失、蛋白质变性,释放出溶菌酶引起细菌自溶。然而,ESL是否对动物特别是水生动物的重要病原菌—嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,AH)具有体内抗感染效果,其抗感染机理如何,尚未见报道。本研究采集苦地胆,利用超声波辅助提取、加压硅胶柱层析等技术制备ESL,利用模式实验动物斑马鱼(Danio rerio),进行ESL体内抗AH菌感染保护效果试验,并初步探索ESL体内抗感染的机理,以补充ESL体内抗感染研究的内容,为ESL成为中草药来源的抗菌饲料添加剂奠定理论与试验基础。主要研究结果如下:1.采用超声波辅助提取、加压硅胶柱层析等技术能够制备到苦地胆种内酯、异苦地胆种内酯和去氧苦地胆内酯,以石油醚︰氯仿︰乙醚(3︰5︰2)为展开剂,薄层层析法(thin layer chromatography,TLC)法测得三者Rf值分别为0.364、0.316和0.161。2.ESL对AH菌有显著的体外抑菌作用,对AH菌的MIC、MBC分别为12.5mg/ml、15.6mg/ml。3.饲料中添加一定剂量的ESL能对AH菌感染斑马鱼形成保护作用,高剂量ESL组(0.8%、1.6%)保护效果显著优于低剂量ESL组(0.2%、0.4%),与0.1%恩诺沙星的保护效果相当。4.投喂ESL含量为0.8%和1.6%的饲料,能使斑马鱼在AH菌致病性胞外产物溶液中存活时间显著高于对照组,说明高剂量的ESL能增强斑马鱼抗AH菌致病性胞外产物的能力。5.饲料中添加不同剂量的ESL对斑马鱼的头肾指数及脾脏指数没有影响。6.饲料中添加0.8%和1.6%的ESL能够显著提高斑马鱼体表黏液、肝脏及鳃中溶菌酶的活性;添加0.4%的ESL能显著提高斑马鱼体表黏液中溶菌酶的活性。7.饲料中添加0.8%、1.6%的ESL能够显著提高斑马鱼肝脏碱性磷酸酶活性。8.饲料中添加1.6%的ESL能够显著提高斑马鱼鳃总超氧化物歧化酶活性。9.饲料中添加0.8%的ESL能够显著提高斑马鱼鳃组织中IgM含量。10.ESL能有效防控AH菌对斑马鱼感染的可能机理是:通过直接抑菌杀菌作用减少AH菌的数量;通过增强斑马鱼抗AH菌致病性胞外产物的能力降低其对斑马鱼机体的危害;通过提高斑马鱼体内水解酶类如溶菌酶、碱性磷酸酶活性来杀灭AH菌;通过提高斑马鱼超氧化物歧化酶活性,以清除已完成杀伤病原功能的吞噬细胞内超氧化物自由基;通过提高斑马鱼组织中IgM含量,增强机体的体液免疫功能。
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