【摘 要】
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目的:重组腺相关病毒（r AAV）已在基因治疗领域广泛应用了数十年。但是,由于r AAV载体不能有效地通过血脑屏障（BBB）,导致其在中枢神经系统（CNS）疾病治疗中的应用非常有限。所以本课题主要针对如何提高AAV在中枢神经系统中的转导效率进行探索。研究方法:1、首先构建带有绿色荧光蛋白（GFP）的重组腺相关病毒AAV9,并利用AAV9与不同的细胞穿膜肽（CPP）相互作用并且以不同浓度感染HEK2
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目的:重组腺相关病毒（r AAV）已在基因治疗领域广泛应用了数十年。但是,由于r AAV载体不能有效地通过血脑屏障（BBB）,导致其在中枢神经系统（CNS）疾病治疗中的应用非常有限。所以本课题主要针对如何提高AAV在中枢神经系统中的转导效率进行探索。研究方法:1、首先构建带有绿色荧光蛋白（GFP）的重组腺相关病毒AAV9,并利用AAV9与不同的细胞穿膜肽（CPP）相互作用并且以不同浓度感染HEK293T、h CMEC/D3、HAs三种细胞。通过使用荧光显微镜观察,实时荧光光定量PCR（RT-q PCR）法和经典Western blot方法检测AAV9携带基因GFP的表达情况。2、通过免疫荧光共定位法探究AAV9与CPP是否有相互作用。3、通过改变AAV9与CPP相互作用时间与作用温度检测复合物对转导效率的影响。4、通过构建体外血脑屏障模型评估AAV9-CPP复合物是否提高AAV9透过血脑屏障的能力。5、利用尾静脉注射的方式进行体内实验,通过免疫组化、RT-q PCR检测GFP与体内炎症因子的表达情况。结果:在体外实验中,通过分子、蛋白水平的检测。我们发现三种CPP:LAH4,LEPTIN30和APOE可以显著增强AAV9的体外转导效率,其中LAH4的提高效果最明显。且LAH4对AAV9转导的增强依赖于AAV9衣壳与LAH4的结合。在体内实验中,通过免疫组化检测,AAV9-LAH4复合物增加了AAV9在CNS中的转导。我们的结果表明LAH4可能通过与AAV9相互作用,增加该AAV载体穿过BBB的能力,并且进一步增强脑中靶基因的表达。结论:1、AAV9与CPP复合物可以提高AAV9在HEK293T、h CMEC/D3、HAs细胞中的转导,且作用效果最好的为LAH4。2、AAV9与LAH4复合物可以提高AAV9透过体内血脑屏障的能力,且复合物未引起炎症反应。
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