【摘 要】
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乳腺炎是山羊常见疾病,具有发病率高、治愈率低、在高产奶山羊的泌乳盛期常见的特点,可导致母羊泌乳量和乳品质下降,对养殖业造成严重经济损失。金黄色葡萄球菌是诱发山羊乳腺炎的重要生物因素之一。课题组前期通过加权基因共表达网络分析（Weighted correlation network analysis,WGCNA）发现泛素耦联基因UBE2L6（Ubiquitin conjugating enzyme
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（No.31572368）；
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乳腺炎是山羊常见疾病,具有发病率高、治愈率低、在高产奶山羊的泌乳盛期常见的特点,可导致母羊泌乳量和乳品质下降,对养殖业造成严重经济损失。金黄色葡萄球菌是诱发山羊乳腺炎的重要生物因素之一。课题组前期通过加权基因共表达网络分析（Weighted correlation network analysis,WGCNA）发现泛素耦联基因UBE2L6（Ubiquitin conjugating enzyme E2L6,UBE2L6）是山羊乳腺感染金黄色葡萄球菌24 h的核心响应基因,蛋白互作网络分析（protein protein interaction network,PPI network）发现UBE2L6可能通过信号传导及转录活化因子1（Signal transducers and activators of transcription,STAT1）调节凋亡蛋白抑制因子3（Baculovirus IAP repeating containing 3,BIRC3）。因此,本研究通过以甲醛灭活的金黄色葡萄球菌（Formaldehyde-killed Staphylococcus aureus,FK S.a）处理山羊乳腺上皮细胞（Goat mammary epithelial cells,GMECs）,构建金黄色葡萄球菌炎性GMECs模型。在炎症条件下,通过实时荧光定量PCR和Western Blotting等检测方法,探究UBE2L6对FK S.a诱导的GMECs凋亡的分子调控机制。主要研究结果如下:（1）FK S.a处理GMECs 24 h,细胞中IL-6、IL-10基因m RNA表达量极显著升高（P＜0.01）,IL-1β基因m RNA表达量显著升高（P＜0.05）,表明成功构建金黄色葡萄球菌炎性GMECs模型;细胞中UBE2L6基因m RNA表达显著升高（P＜0.05）。表明,FK S.a促进GMECs中UBE2L6基因表达。（2）克隆获得山羊UBE2L6基因CDS区全长,得到提高UBE2L6表达20倍以上的重组载体pc DNA3.1-UBE2L6,转染FK S.a处理24 h的GMECs,发现STAT3、BIRC3m RNA表达升高,STAT1、Caspase3 m RNA表达降低;BIRC3、p-STAT3（tyr705）/STAT3水平升高,STAT1、Cleaved-Caspase3/Caspase3水平降低。（3）获得降低UBE2L6表达50%以上si-UBE2L6,转染FK S.a处理24 h的GMECs,发现STAT1、Caspase3 m RNA表达升高,STAT3、BIRC3 m RNA表达降低;STAT1、Cleaved-Caspase3/Caspase3水平升高,BIRC3、p-STAT3（tyr705）/STAT3水平降低。（4）FK S.a处理24h的GMECs中,UBE2L6与STAT1、STAT1与STAT3之间存在蛋白互作关系。（5）FK S.a处理24h的GMECs中,外源添加1u M蛋白酶体抑制剂MG132,发现ub蛋白水平显著升高（P＜0.05）,p-STAT3（tyr705）/STAT3水平极显著升高（P＜0.01）,STAT1水平显著降低（P＜0.05）。表明金黄色葡萄球菌炎性GMECs中,UBE2L6通过泛素化降解STAT1,进而激活下游STAT3（tyr705）的磷酸化。（6）FK S.a处理24h的GMECs中,外源添加10u M的STAT3磷酸化抑制剂cryptotanshinone,发现p-STAT3（tyr705）/STAT3和BIRC3水平极显著降低（P＜0.01）。表明金黄色葡萄球菌炎性GMECs中,UBE2L6通过激活p-STAT3（tyr705）,进而促进BIRC3表达。以上研究结果表明,在金黄色葡萄球菌炎性GMECs中,UBE2L6通过泛素化降解STAT1,促进p-STAT3（tyr705）水平升高,进而使下游BIRC3升高,最终导致细胞凋亡降低。
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