【摘 要】
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基因突变,作为一种重要的临床生物标志物与多种疾病,特别是癌症的发生、发展密切相关。基因突变是基因内部发生的变化,包括碱基的替换、插入、缺失等,其中基因的单碱基替换突变（基因点突变）最常发生。由于突变链与野生链仅有一个碱基的差异,难以引起明显的物理或化学信号变化,检测难度较大。另外,在临床样本,特别是癌症早期的临床样本中,突变链淹没在大量的野生链中,丰度占比极低（＜1%）,进一步加大了检测的难度。目
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（No.82172372,21904045）；
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基因突变,作为一种重要的临床生物标志物与多种疾病,特别是癌症的发生、发展密切相关。基因突变是基因内部发生的变化,包括碱基的替换、插入、缺失等,其中基因的单碱基替换突变（基因点突变）最常发生。由于突变链与野生链仅有一个碱基的差异,难以引起明显的物理或化学信号变化,检测难度较大。另外,在临床样本,特别是癌症早期的临床样本中,突变链淹没在大量的野生链中,丰度占比极低（＜1%）,进一步加大了检测的难度。目前开发的低丰度基因点突变检测方法往往需要通过复杂的序列设计、繁琐的温度优化或依赖昂贵的分析仪器来实现,不利于临床的大规模应用。为了克服上述问题,本论文选择具有较高单碱基错配区分能力的核酸内切酶Ⅳ（Endonuclease Ⅳ,Endo Ⅳ）作为野生链和突变链的差异放大器,以Endo Ⅳ的性质探究为切入点,构建了一系列恒温、简单、高灵敏和低成本的基因点突变检测方法,并将其应用于临床表皮生长因子受体相关突变的检测中。论文的研究方法:本论文从Endo Ⅳ水解双链或单链DNA中脱嘌呤/脱嘧啶（apurinic/apyrimidinic,AP）位点的作用机制入手。通过设计合适的荧光和猝灭基团双重修饰的AP探针链及能与AP探针链杂交形成不同双链结构的目标链,采用荧光分析的方法,寻找Endo Ⅳ对目标链与AP探针链杂交所形成不同结构底物的水解活性规律并将其应用于基因点突变的检测中。论文的研究结果:本论文的研究结果主要有:（1）Endo Ⅳ水解单链DNA中AP位点的性质对Endo Ⅳ用于基因点突变的检测会产生不利影响。本研究发现该副活性产生的原因或与柔性单链DNA的分子内或分子间瞬时结合相关,可通过添加与该AP单链部分杂交的辅助链来抑制。Endo Ⅳ的副活性被抑制后,Endo Ⅳ对突变链和野生链的区分因子提升约20倍。（对应论文第二章）（2）打破了Endo Ⅳ最适底物为完全匹配的双链型底物的传统认知,发现Endo Ⅳ对AP探针与目标链在AP位点3’下游或5’上游仅形成一个或三个碱基的凹陷型双链底物具有更高的水解活性。此外,这些特殊底物结构提升了Endo Ⅳ对单碱基错配的区分能力。联合lambda核酸外切酶、脱氧核酶、不对称聚合酶链式反应,可实现对丰度低至0.01%突变链的检测。（对应论文第三到五章）（3）人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1和两种常见限制性内切酶（Nt.Bsm AI and Nt.Bst NBI）也具有与Endo Ⅳ相似的底物识别特性。（对应论文第六章）结论:本论文从Endo Ⅳ的底物识别机制切入,基于发现的Endo Ⅳ新的底物识别特性,层层递进,开发了一系列简单、通用地检测基因点突变的方法,并成功应用于多种临床相关基因点突变的检测中。此外,本论文针对Endo Ⅳ性质探究的方法,也可应用于其他核酸内切酶,拓展了对核酸内切酶的认知,也为探究酶的性质提供了新的思路。最后,本论文还对工作的不足及未来可以继续开展的课题方向进行了展望（对应论文第七章）,另外,对核酸酶在基因点突变检测领域的应用进行了总结（对应论文第八章）,以期为新的基因点突变检测方法的开发提供思路和助力。
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