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信号素3A（Semaphorin3A,SEMA3A）信号通路具有促进成骨细胞生成和抑制破骨细胞形成的双重调控作用,该信号通路基因可能是潜在的骨质疏松（Osteoporosis,OP）遗传易感基因。肠道菌群也参与调节骨代谢活动,识别与疾病相关的微生物标志物,可能为OP的治疗提供新的方向。基于此,本研究将通过以下三个部分探讨SEMA3A信号通路遗传变异、肠道菌群和OP发生风险的关联。第一部分SEMA3A信号通路遗传变异与骨质疏松发病风险关联研究目的:识别与OP相关的SEMA3A信号通路遗传变异,并揭示变异位点影响疾病相关骨形成、骨吸收的潜在生物学机制。方法:本研究纳入2016–2019年从武汉市内两个社区、武汉协和医院体检中心和武汉协和医院康复中心招募的481例OP病例和778例对照作为研究对象。采用二代测序方法对SEMA3A、NRP1、PLXNA1、PLXNA2和PLXNA3目标区域进行测序,使用i MLDR技术对测序阶段发现的阳性关联单核苷酸多态性位点（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）进行分型验证。应用Logistic回归和多元线性回归分析常见变异与OP发生风险和骨密度（Bone mineral density,BMD）的关联;采用Fisher精确检验比较组间罕见变异的等位基因频率分布,采用简单线性回归分析罕见变异与BMD的关联。使用生物信息学工具对疾病易感性位点进行功能注释,并开展功能实验探索变异位点影响疾病发生的可能机制。结果:测序阶段发现10个位点与OP发生风险相关。验证阶段发现PLXNA2rs2274446与OP发病风险降低相关(CT/TT vs CC:OR=0.63,95%CI=0.46–0.87,PFDR=0.027)。合并阶段发现NRP1 rs2070296(TT vs CC/CT:OR=1.63,95%CI=1.21–2.19,PFDR=0.007)和rs2274446(TT vs CT vs CC:OR=0.72,95%CI=0.58–0.89,PFDR=0.016)与OP发病风险显著关联;rs2070296 TT基因型与股骨颈BMD降低相关(β=-0.03,PFDR=0.004);rs2274446 CT/TT基因型与股骨颈BMD上升相关(β=0.03,PFDR=0.002);随着NRP1 rs180868035 G等位基因增加,腰椎(β=-0.17,PFDR=0.032)和股骨颈BMD(β=-0.12,PFDR=0.040)显著降低。SIFT和Mutation Taster功能预测软件均提示NRP1 rs180868035 T＞G突变（p.I140L）对蛋白质功能有影响。功能实验发现NRP1 I140L能够降低成骨细胞标志基因表达,抑制成骨细胞分化和增殖,促进成骨细胞凋亡;并增加破骨细胞标志基因表达,促进破骨细胞分化和增殖,抑制破骨细胞凋亡。结论:NRP1 rs2070296和PLXNA2 rs2274446与OP发病风险和股骨颈BMD关联,NRP1 rs180868035与腰椎和股骨颈BMD相关。功能实验提示非同义变异位点rs180868035（p.I140L）可能通过减少骨形成并促进骨吸收的双重作用影响骨量变化。第二部分肠道菌群与骨质疏松患病风险关联研究目的:探索OP患者肠道菌群组成和多样性变化,识别与疾病相关的菌群。方法:纳入2018–2019年从武汉协和医院康复中心招募,提供粪便样本的108名老年人作为研究对象,采用16S扩增子绝对定量测序技术进行肠道菌群分类鉴定和绝对定量。采用Observed Species、Chao1、ACE、Shannon、Simpson和Coverage指数评估菌群Alpha多样性。通过置换多因素方差分析（Permutational Multivariate Analysis of Variance,PERMANOVA）评估组间肠道菌群组成的差异性,采用线性判别分析（Linear Discriminant Analysis,LDA）效应量方法（LDA Effect Size,LEf Se）筛选组间差异菌。结果:本部分纳入44例OP病例和64例对照。组间Alpha多样性差异无统计学意义（P＞0.05）。PERMANOVA分析发现病例组和对照组的菌群组成存在显著差异（P=0.022）。LEf Se分析发现拟杆菌门、拟杆菌纲和拟杆菌目在病例组富集;在科分类水平上,病例组的拟杆菌科（Bacteroidaceae）、乳杆菌科、紫单胞菌科的绝对丰度均高于对照组;在属分类水平上,病例组的拟杆菌属（Bacteroides）、乳杆菌属、Clostridium＿Xl Va、Eggerthella、艾森伯格菌属和粪芽孢菌属绝对丰度增高,韦荣球菌属丰度减少。结论:病例组OP患者和对照组研究对象的肠道菌群组成存在显著差异,主要表现为拟杆菌门和厚壁菌门下多个菌属的绝对丰度发生了变化,提示肠道菌群和OP发生相关。第三部分肠道菌群在SEMA3A信号通路遗传变异与骨质疏松关联中的作用探讨目的:探索肠道菌群在SEMA3A信号通路遗传变异与OP关联中的作用。方法:本部分纳入的研究对象为前两部分重叠人群,即同时有肠道菌群数据和基因分型数据的人群。将与OP显著关联的常见变异NRP1 rs2070296和PLXNA2rs2274446纳入分析。采用Observed Species、Chao1、ACE、Shannon、Simpson和Coverage指数评估Alpha多样性。通过PERMANOVA分析评估SNPs不同基因型间的肠道菌群组成是否存在差异。使用LEf Se分析筛选SNPs不同基因型间的差异菌。运用中介分析探索菌群在SNPs与OP关联中的间接效应。利用Logistic回归模型通过加入交互项的形式分析SNPs与肠道菌群的交互作用。结果:本部分纳入37例OP病例和57例对照。NRP1 rs2070296 TT基因型携带者Alpha多样性指数Chao1和ACE低于CC/CT基因型携带者（Chao1:P=0.040;ACE:P=0.039）;PLXNA2 rs2274446 CT/TT基因型携带者的Alpha多样性指数Shannon比CC基因型携带者低,Simpson比CC基因型携带者高（Shannon:P=0.038;Simpson:P=0.042）。PERMANOVA分析发现rs2274446 CT/TT基因型携带者和CC基因型携带者的菌群组成存在差异（P=0.020）。LEf Se分析发现rs2274446 CT/TT基因型携带者Bacteroidaceae和Bacteroides丰度降低。结合第二部分研究结果发现Bacteroidaceae和Bacteroides与rs2274446和OP均相关。中介分析发现Bacteroidaceae和Bacteroides在rs2274446与OP关联中存在间接效应（P＜0.05）。未发现rs2070296或rs2274446和肠道菌群间存在交互作用。结论:NRP1 rs2070296和PLXNA2 rs2274446和肠道菌群的多样性降低相关,提示肠道菌群可能受宿主遗传因素调控。Bacteroidaceae和Bacteroides在PLXNA2rs2274446与OP的关联中存在显著的间接效应,PLXNA2 rs2274446对OP的影响可能部分是通过调节肠道菌群进行实现。