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大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)O157:H7面临不良环境胁迫时会进入活的不可培养(viable but nonculturable state,VBNC)状态,无法在常规培养基上生长繁殖,从而造成食源性致病菌的漏检,给人类健康造成严重威胁。因此,本课题选取E.coli O157:H7作为研究对象,通过敲除基因技术获得突变株,研究野生株和基因缺陷株进入VBNC状态的差异,及基因缺失导致E.coli O157:H7的生物学特性的改变。研究内容包括三个部分:用Red两步同源重组的方法构建E.coli O157:H7的基因缺陷株,富营养低温诱导E.coli O157:H7基因缺陷株进入VBNC状态,以及探究E.coli O157:H7基因缺陷株的生物学特性。本课题敲除方案:选取可能对E.coli O157:H7 VBNC形成的三个关键基因fimC、luxS和rpoS,运用PCR技术扩增出其两翼与打靶基因上下游同源,中间为卡那霉素抗性基因的DNA片段。通过电转化的方法,将外源DNA片段转入预先导入质粒pKD46的E.coli O157:H7中。诱导Red重组酶的表达,外源DNA片段与染色体上的同源区域发生重组,将靶基因置换下来。最后FLP重组酶与卡那霉素抗性基因侧翼的FRT位点结合,切除卡那霉素抗性基因,从而得到三个靶基因重组敲除缺陷菌株E.coli O157-?luxS、E.coli O157-?rpoS和E.coli O157-?fimC。课题探究了E.coli O157:H7野生株与基因缺陷株进入VBNC状态的差异。结合吖啶橙直接计数(acridine orange direct counts,AODC)法、活菌直接计数(direct viable counts,DVC)法和平板计数(plate counts,PC)法观察VBNC诱导过程中细菌的变化发现,在-20℃富营养诱导条件下E.coli O157:H7-?rpoS缺陷株18天便完全进入VBNC状态,与野生株和其他缺陷株相比,其诱导进入VNBC状态时间缩短了一半;在整个VBNC诱导过程中总菌数变化不大,活菌数比总菌数低1~2数量级;进入VBNC状态后,细菌的形态由杆状变成球状。最后,研究了E.coli O157:H7野生株与基因缺陷株在生物学特性的差异。研究发现,传代10次的基因缺陷株与初代基因缺陷株相比没有遗传水平上的差异;fimC基因缺失会造成E.coli O157:H7菌株运动性降低;rpoS基因缺失使E.coli O157:H7应对酸胁迫的能力严重降低;与野生型E.coli O157:H7相比,fimC和luxS基因缺失在一定程度上影响细菌生物被膜的形成。本课题针对食源性致病菌E.coli O157:H7基因缺失株的进入VBNC状态的机理研究,阐述E.coli O157:H7的基因缺陷株生物学特性,以期为食品加工工艺安全奠定理论基础,为食源性致病菌的防控提供可靠的参考依据。