1、研究背景骨折分期的辨证施治方法是中医治疗骨折的一大特色,是前人经过不断总结发展而来的。中医骨伤学家总结了骨折三期辨证治疗,骨折三期治疗原则是中医药治疗骨折的指导原则。中医骨折三期治则临床疗效已证实,但实验证据不完善。虽然临床疗效已得到充分的验证,但对其研究往往局限于临床疗效观察。目前对中医骨折三期治则的作用存在诸多争议,无论在是否分期还是在分期的方法上都有明显的分歧,出现了不分期的治疗,以及分期的三期治疗和二期治疗的不同情况,使得骨折三期治疗做为中医药治疗骨折的指导原则的地位受到严峻的挑战,导致了中医药在治疗骨折的发展受到严重的制约。但是既往研究较多为临床疗效的初步观察,而且均是中药汤剂组与空白对照组、单味中药与空白对照组或某种中成药与空白对照组之间的相互做比较,所以认为不分期的一期治疗或二期治疗能够促进骨折愈合,但并均不能充分说明一期治疗与二期治疗疗效强于三期治疗。而关于中医骨折三期治疗原则的作用及其机制系统的实验研究,尚未见文献报道。本课题组前期研究发现在SD大鼠骨痴愈合过程中,二期治疗不但可以明显提高其骨折愈合过程中bFGF (Basic fibroblast growth factor碱性成纤维细胞生长因子)的表达量,二期治疗对骨折愈合过程中bFGF表达的促进作用显著强于期治疗和一期治疗。并在前期的家兔骨折愈合过程的实验研究中,发现在骨折愈合时间及质量上分期的治疗组明显强于不分期治疗组,骨折三期治疗组无论在外骨膜、骨干细胞、骨小梁组织、骨痂质量及骨髓组织等骨折端组织的VEGF (Vascular endothelial growth factor血管内皮生长因子)和VEGF mRNA表达的促进作用明显优于一期治疗组。bFGF有促血管形成、诱导胚胎发育、促进神经生长等功能。另外TGF-p (Transforming growth factor-β转化生长因子β),可促进骨膜间充质细胞增殖和分化,促进成骨细胞增殖、刺激Ⅱ型胶原、骨连接素和骨桥蛋白的合成,TGF-p在骨组织代谢过程中起重要的作用。而VEGF是目前公认最强的促血管形成因子,不仅能够促进血管重建,而且还能够增强软骨细胞活性,其他促血管生成因子对于血管重建时全部或部分通过VEGF的作用得以实现。bFGF与VEGF两因子都是对血管重建较为重要的因子,而骨的愈合过程中,骨形成的最关键因子的莫过于BMPs (Bone morphogenetic proteins骨形成蛋白),其具有诱导成骨作用,尤其是间充质细胞发生化学趋向、聚集、分化形成软骨和骨,最终形成骨髓,因此,被认为是最强的骨诱导分化因子,而实验研究方面对于在骨折愈合过程中较为重要的BMPS多进行其家族的BMP-2研究。我们为较全面的从分子生物水平更进一步探讨中医骨折分期治疗的作用及其机制,研究骨折治疗的合理分期方法,因此,本实验对中医分期治疗将从bFGF、TGF-β、VEGF及BMP-2四个生长因子同时进行全方位的分析。2、研究目的本研究拟通过对家兔双侧桡骨中下1/3旋前圆肌远端3mm横断骨折的bFGF、TGF-β、VEGF、BMP-2及其bFGFmRNA、TGF-PmRNA、VEGFmRNA、 BMP-2mRNA的基因表达、细胞因子的表达及其分布规律的影响情况,从分子水平层次对家兔桡骨下段骨缺损的愈合进行分期,进而从器官、细胞与分子水平系统地阐明中医骨折分期治疗对骨折愈合的作用及其机制,确定最佳的分期治疗方案,阐明中医骨折分期治疗的原则,从现代医学的角度为中医药分期治疗骨折提供更为科学的理论根据,指导骨折的治疗。3、材料与方法3.1研究对象及建立骨折模型本实验研究对象为实验用雄性新西兰家兔174只,于双侧桡骨中下1/3处在旋前圆肌肌止远端用锯造成3mm横断骨折,不作任何固定。用计算机产生随机数字的方法将174只家兔先随机取出6只作为对照组,其余168只家兔随机分为四组,每组42只。分别为中药三期治疗组、中药二期治疗组、中药一期治疗组、模型对照组。每个小组再随机分为7个小组,每组6只。分别为3、6、9、14、28、42、56天组。3.2干预方法3.2.1给药方法：将家兔桡骨骨折愈合过程分为三期：早期,即血肿机化演进期,骨折后1-7天；中期,即原始骨痂形成期,骨折后8-28天；后期,即改建塑形期,骨折后28天以后。本研究所选用的肢伤一方、二方及三方选自高等中医药院校统编教材《中医正骨学》。1组：中药三期治疗组将骨折愈合过程分为三期,早期,活血化瘀、行气止痛,给予肢伤一方,中期,接骨续筋、舒筋活络,给予肢伤二方：末期,补益肝肾、强筋壮骨,给予肢伤三方。2组：中药二期治疗组将骨折愈合过程分为两期,早期,给予肢伤一方加减方；将中医骨折三期治疗的中期和末期合并为后期,给予肢伤二方与三方的综合方(后期方)。3组：中药一期治疗组将骨折愈合过程不分期,给予肢伤一方、二方与三方的综合方(一期方)。4组：模型对照组给予等量蒸馏水,灌胃,每日2次。5组：空白对照组给予等量蒸馏水,灌胃,每日2次。3.3标本处理术后第3、6、9、14、28、42、56天每组随机抽取一小组家兔用空气栓塞法处死,取左侧桡骨标本为观察对象,经固定,脱钙及HE染色切片制作等程序,采用免疫组化及原位杂交的方法观察骨折不同时间点bFGF、TGF-β、VEGF、BMP-2及其bFG|mRNA、TGF-βmRNA、VEGFmRNA、BMP-2mRNA的表达情况,在骨折中心以及两断端附近相同位置取9个高倍镜视野,采用美国3Y彩色图像分析系统与Pixelpro Ver4.0图像分析软件对阳性表达细胞进行光密度测定。3.4统计分析采用SPSS20.0统计软件对实验数据进行统计分析,采用一般线性模型的重复测量过程对骨折愈合过程中每种组织MOD值组间差异进行比较,并应用LSD法对每个时间点组间差异进行比较,结果采用均数±标准差(χ±s),表示检验水准α=0.05。4结果4.1bFGF及bFGFmRNA表达的结果4.1.1外骨膜bFGF表达结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,P<0.01；一期组高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05；其中二期组最高,高于三期组,有显著性差异,P<0.05,也高于一期组,差异非常显著,P<0.01。术后第9天,三组治疗组均达到高峰,但明显分期组明显最高,二期组高于模型对照组,差异非常显著,P<0.01；二期组高于一期组,三期组高于模型对照组,均有显著性差异,P<0.05。总体而言,分期组均保持较高的水平,且明显强于模型对照组以及不分期的一期组。4.1.2外骨膜bFGFmRNA表达结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,P<0.01；一期组高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05；其中二期组最高,高于三期组,有显著性差异,P<0.05,也高于一期组,差异非常显著,P<0.01；三期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05。术后第9天,二期组达到高峰,二期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05。从总体而言,分期组无论高峰期还是峰值水平均强于不分期的一期组和模型对照组。4.1.3内骨膜bFGF表达的结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,P<0.01；一期组高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05；其中二期组最高,高于三期组,有显著性差异,P<0.05,也高于一期组,差异非常显著,P<0.01；三期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05。术后第9天,二期组高于一期组、模型对照组,差异非常显著,P<0.01；三期组高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05。从总体而言,分期治疗组峰值水平仍高于不分期组及模型对照组。4.1.4内骨膜bFGFmRNA表达的结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,二期组高于一期组和三期组,差异非常显著,P<0.01；一期组高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05；三期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05。术后第9天,二期组高于一期组、模型对照组,差异非常显著,P<0.01；也高于三期组,有显著性差异,P<0.05。总体而言,分期组峰值水平以及高峰期均强于一期组及模型对照组。4.1.5骨髓腔bFGF表达的结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,二期组高于一期组,差异非常显著,P<0.01；二期组高于三期组,一期组高于模型对照组,三期组高于一期组,均有显著性差异,P<0.05。术后第14天,二期组高于模型对照组,差异非常显著,P<0.01；二期组高于三期组,有显著性差异,P<0.05。从总体而言,分期组的峰值水平及高峰期均强于不分期的一期组。4.1.6骨髓腔bFGFmRNA表达的结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,二期组高于一期组,差异非常显著,P<0.01；二期组高于三期组,一期组高于模型对照组,三期组高于一期组,均有显著性差异,P<0.05。术后第14天,三期组高于模型对照组,差异非常显著,P<0.01；二期组高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05。从总体而言,分期组大部分时间点的峰值水平及高峰期均强于不分期的一期组。4.2TGF-β及TGF-β mRNA表达的结果4.2.1外骨膜TGF-β表达结果均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,二期组高于一期组,差异非常显著,P<0.01；二期组高于三期组,一期组高于模型对照组,三期组高于一期组,均有显著性差异,P<0.05。术后第42天,二期组高于一期组、三期组、模型对照组,三期组高于一期组,均差异非常显著,P<0.01。总体而言,分期组均保持较高的水平,且明显强于模型对照组以及不分期的一期组。4.2.2外骨膜TGF-β mRNA表达结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,二期组高于一期组,差异非常显著,P<0.01；二期组高于三期组,有显著性差异,P<0.05。术后第42天,二期组高于一期组、模型对照组,均差异非常显著,P<0.01；二期组高于三期组,三期组高于一期组,均有显著性差异,P<0.05。从总体而言,分期组无论高峰期还是峰值水平均强于不分期的一期组和模型对照组。4.2.3内骨膜TGF-β表达的结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,二期组高于一期组,差异非常显著,P<0.01；二期组高于三期组,三期组高于期组,一期组高于模型对照组,均有显著性差异,P<0.05。术后第42天,二期组高于一期组、三期组、模型对照组,均差异非常显著,P<0.01；三期组高于一期组、模型对照组,均有显著性差异,P<0.05。从总体而言,分期治疗组峰值水平仍高于不分期组及模型对照组。4.2.4内骨膜TGF-β mRNA表达的结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,二期组高于一期组,差异非常显著,P<0.01；二期组高于三期组,三期组高于一期组,一期组高于模型对照组,均有显著性差异,P<0.05。术后第42天,二期组高于一期组、模型对照组,三期组高于一期组,均差异非常显著,P<0.01；二期组高于三期组,三期组高于一期组、模型对照组,均有显著性差异,P<0.05。总体而言,分期组峰值水平以及高峰期均强于一期组及模型对照组。4.2.5骨干细胞TGF-β表达的结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,二期组高于一期组,差异非常显著,P<0.01；二期组高于三期组,三期组高于一期组,一期组高于模型对照组,均有显著性差异,P<0.05。术后第42天,二期组高于一期组、模型对照组,均差异非常显著,P<0.01；二期组高于三期组,三期组高于模型对照组,均有显著性差异,P<0.05。从总体而言,分期组的峰值水平及高峰期均强于不分期的一期组。4.2.6骨干细胞TGF-βmRNA表达的结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,二期组高于一期组,差异非常显著,P<0.01；二期组高于三期组,三期组高于一期组,一期组高于模型对照组,均有显著性差异,P<0.05。术后第42天,二期组高于模型对照组、一期组；三期组高于模型对照组,均差异非常显著,P<0.01；二期组高于三期组,一期组高于模型对照组,均有显著性差异,P<0.05。从总体而言,分期组大部分时间点的峰值水平及高峰期均强于不分期的一期组。4.3VEGF及VEGFmRNA表达的结果4.3.1外骨膜VEGF表达结果组间两两比较,三组中药治疗组MOD值显著强于模型对照组,P<0.01。其中二期组的平均MOD值最高,二期组高于三期组,有显著性差异,P<0.05,三期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05,一期组高于模型对照组,差异非常显著,P<0.01。术后第6天,二期组最高,与一期组及模型对照组相比,差异非常显著,P<0.01；三期组高于一期组和模型对照组,有显著性差异,P<0.05。总体而言,分期组均保持较高的水平,且明显强于模型对照组以及不分期的一期组。4.3.2外骨膜VEGFmRNA表达结果组间两两比较,二期、三期治疗组MOD值显著强于模型对照组,P<0.01,一期治疗组MOD值显著高于模型对照组,P<0.05。其中二期组的平均MOD值最高,二期组高于三期组,有显著性差异,P<0.05,三期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05,一期组高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05。术后第6天,二期组高于模型对照组,差异非常显著,P<0.01；二期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05。从总体而言,分期组无论高峰期还是峰值水平均强于不分期的一期组和模型对照组。4.3.3内骨膜VEGF表达的结果平均值组间两两比较,一期组、二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,P<0.01；其中二期组最高,高于三期组,有显著性差异,P<0.05；三期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05。术后第6天,二期组高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05；二期组高于一期组,差异非常显著,P<0.01。从总体而言,分期治疗组峰值水平仍高于不分期组及模型对照组。4.3.4内骨膜VEGFmRNA表达的结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,P<0.01；一期组强于模型对照组,差异具有统计学意义,P<0.05；其中二期组最高,高于三期组,有显著性差异,P<0.05,也高于一期组,差异非常显著,P<0.01：三期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05。术后第6天和术后第9天,二期组均高于模型对照组,差异非常显著,P<0.01；二期组均高于一期组,有显著差异,P<0.05；三期组均高于模型对照组,有显著差异,P<0.05。总体而言,分期组峰值水平以及高峰期均强于一期组及模型对照组。4.3.5骨髓腔VEGF表达的结果平均值组间两两比较,一期组、二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,P<0.01；其中二期组最高,高于三期组,有显著性差异,P<0.05,也高于一期组,差异非常显著,P<0.01；三期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05。术后第9天,二期组高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05；二期组均高于期组,差异非常显著,P<0.01；三期组均高于一期组,有显著差异,P<0.05。从总体而言,分期组的峰值水平及高峰期均强于不分期的一期组。4.3.6骨髓腔VEGFmRNA表达的结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,P<0.01；一期组强于模型对照组,有显著性差异,P<0.05；其中二期组最高,高于三期组,有显著性差异,P<0.05,也高于一期组,差异非常显著,P<0.01：三期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05。术后第9天,二期组高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05；二期组均高于一期组,差异非常显著,P<0.01；三期组均高于一期组,有显著差异,P<0.05。从总体而言,分期组大部分时间点的峰值水平及高峰期均强于不分期的一期组。4.4BMP-2及BMP-2mRNA表达的结果4.4.1外骨膜BMP-2表达结果平均值组间两两比较,一期组、二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,P<0.01；其中二期组最高,高于三期组,有显著性差异,P<0.05,也高于一期组,差异非常显著,P<0.01；三期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05。术后第42天,二期组、三期组均高于模型对照组,差异非常显著,P<0.01；一期组强于模型对照组,有显著性差异,P<0.05。总体而言,分期组均保持较高的水平,且明显强于模型对照组以及不分期的一期组。4.4.2外骨膜BMP-2mRNA表达结果平均值组间两两比较,一期组、二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,P<0.01；其中二期组最高,高于三期组,有显著性差异,P<0.05,也高于一期组,差异非常显著,P<0.01；三期组高于一期组,差异非常显著,P<0.01。术后第42天,二期组、三期组均高于模型对照组,差异非常显著,P<0.01；一期组强于模型对照组,有显著性差异,P<0.05。从总体而言,分期组无论高峰期还是峰值水平均强于不分期的一期组和模型对照组。4.4.3骨干细胞BMP-2表达的结果平均值组间两两比较,一期组、二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,P<0.01；其中二期组最高,高于三期组,有显著性差异,P<0.05,也高于一期组,差异非常显著,P<0.01；三期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05。术后第28天,二期组强于模型对照组,差异非常显著,P<0.01；二期组、三期组均高于一期组,有显著性差异,P<0.05；二期组高于三期组,有显著性差异,P<0.05。从总体而言,分期治疗组峰值水平仍高于不分期组及模型对照组。4.4.4骨干细胞BMP-2mRNA表达的结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,P<0.01；一期组高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05；其中二期组最高,高于三期组,有显著性差异,P<0.05,也高于一期组,差异非常显著,P<0.01；三期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05。术后第14天,二期组高于模型对照组、一期组和三期组,差异非常显著,P<0.01。总体而言,分期组峰值水平以及高峰期均强于一期组及模型对照组。4.4.5骨髓腔BMP-2表达的结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,P<0.01；一期组高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05；其中二期组最高,高于三期组,有显著性差异,P<0.05,也高于一期组,差异非常显著,P<0.01；三期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05。术后第42天,二期组高于模型对照组,差异非常显著,P<0.01；二期组高于一期组,三期组高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05。从总体而言,分期组的峰值水平及高峰期均强于不分期的一期组。4.4.6骨髓腔BMP-2mRNA表达的结果平均值组间两两比较,二期组、三期组的MOD值显著强于模型对照组,P<0.01；一期组高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05；其中二期组最高,高于三期组,有显著性差异,P<0.05,也高于一期组,差异非常显著,P<0.01；三期组高于一期组,有显著性差异,P<0.05。术后第42天,二期组、三期组均高于模型对照组,有显著性差异,P<0.05。从总体而言,分期组大部分时间点的峰值水平及高峰期均强于不分期的一期组。5、结论1)家兔骨折愈合过程中,各部位各时间点的bFGF、TGF-β、VEGF、BMP-2表达的无论从免疫组化还是原位杂交检查中,中药都能够促进骨折愈合过程中不同组织的bFGF、TGF-β、VEGF、BMP-2的表达,可能是中药促进骨折愈合的机制之一。2)骨折三期治疗在不同组织表达都有促进bFGF、TGF-β、VEGF、BMP-2及bFGFmRNA、TGF-βmRNA、VEGFmRNA、BMP-2mRNA的表达作用,这是骨折三期治疗促进骨折愈合的作用机制之一,更显示出骨折分期治疗的必要性。3)骨折愈合过程中的二期组能够更好的发挥作用,使bFGF、TGF-β、VEGF、 BMP-2及bFGFmRNA、TGF-βmRNA、VEGFmRNA、BMP-2mRNA的表达无论峰值水平,还是峰值时间都得到充分的提高,因此,二期治疗是骨折分期的治疗的最合理的分期。6、创新点1)多因子的全面分析骨折愈合过程分析了骨折愈合过程中的促进作用的研究往往为单个因子或者双因子的表达,对各组织当中的bFGF、TGF-β、VEGF、BMP-2表达定量全面分析研究未见报道。2)多基因的表达分析骨折分期治疗的愈合机制通过免疫组化和原位杂交技术研究了骨折分期治疗促进骨折愈合中的bFGF、TGF-β、VEGF、BMP-2表达的影响,探求了骨折分期治疗的愈合机制,揭示了骨折分期治疗的合理分期,尚未报道。