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背景:围手术期神经认知功能障碍（Perioperative Neurocognitive Disorders,PND）是2018年由麻醉神经认知领域的知名学者与多学科专家经过共同讨论后,提出的一个新的专业名词,并在麻醉学领域的知名杂志上同时发表,正式将术后认知功能障碍（Postoperative Cognitive Dysfunction,POCD）和术后谵妄（Postoperative Delirium,POD）两个概念更名为PND,以促进围术期认知功能障碍这一神经认知综合征在不同医学专业间的交流。患者术后一周PND发生率约为17%～43%,术后3个月PND发生率为17%。随着老年患者手术量的逐年增加,PND发生率亦不断攀升,给患者和社会带来沉重的负担。虽然国内外学者已对围术期神经认知功能障碍进行了多年的研究,但其发病机制仍未完全明确。近年来,中枢神经系统炎症反应对认知功能的影响受到了广泛关注,且有关其机制研究正在不断深入。手术部位组织损伤可激活机体的固有免疫系统,引发组织细胞因子释放,导致炎症反应。血脑屏障（Blood Brain Barrier,BBB）是介于脑组织与血液的动态屏障,炎性细胞因子的大量释放可以引起BBB和内皮细胞功能受损,导致BBB通透性增加。外周的炎性细胞因子进入脑内,引起中枢神经系统炎症反应,最终导致PND的发生。研究表明外周炎症的水平,细胞因子进入中枢的数量与中枢神经炎症的严重程度都与循环中的白细胞介素6水平相关。白细胞介素6（Interleukin-6,IL-6）在炎症性疾病的发病机制和神经组织的生理稳态中起关键作用。典型的神经病变,例如多发性硬化症、帕金森氏症和阿尔茨海默氏症的发生都伴有中枢系统内IL-6表达升高。IL-6可通过两种信号通路对细胞进行调控,其一为抗炎作用,在表达膜IL-6受体（membrane-bound IL-6 receptor,m IL-6R）的有限细胞类型中,IL-6可与IL-6R直接结合并激活β-受体糖蛋白130（gp130）和随后的下游蛋白进行信号转导称为IL-6 Classic-signaling,这一信号通路对机体的免疫防御至关重要。另一种则是促炎作用,称为IL-6 Trans-signaling,依赖于可溶形式的IL-6受体（soluble IL-6 receptor,s IL-6R）,它能够结合IL-6结合,形成复合物,可在表达gp130的细胞进行信号转导。大多数神经元缺乏m IL-6R表达,却广泛表达gp130,因此IL-6 Trans-signaling对IL-6在CNS中进行信号转导显得尤为重要。目前已知IL-6与多种中枢神经炎症疾病相关,特别是IL-6是参与外周和中枢炎症关键细胞因子,而有关IL-6 Trans-signaling在围术期神经炎症中的作用,目前还知之甚少。有文献报道IL-6 Trans-signaling是LPS诱导神经炎症和认知行为发生改变的关键。这为深入我们研究Trans-signaling在PND中的作用提供了启发。鉴于Trans-signaling在炎症的发生与促进中占主导作用,尤其是Trans-signaling是IL-6在中枢炎症病理状态的主要信号通路,而过去有关IL-6与PND的研究,并未对Trans-signaling进行报道,特别是Trans-signaling中的关键受体s IL-6R是如何参与中枢炎症和介导动物行为学变化并没有被完全揭示。基于以上的理论,我们推测:1.IL-6 Trans-signaling可能是IL-6介导创伤后中枢神经炎症和认知功能减退的主要的机制。2.海马神经元可能通过响应IL-6 Trans-signaling参与对认知行为的调节,而在中枢内s IL-6R主要来源则是有小胶质细胞提供,此外,s IL-6R也有可能是在外周炎症时与其他炎症介质一起穿透血脑屏障,在中枢内发挥作用。根据以上的假设,我们拟开展两个方面的研究,第一方面为临床研究,拟通过观察接受下肢较大手术的老年患者术后谵妄发生情况;检测术后炎症指标IL-6以及s IL-6R的表达情况;探讨IL-6 Trans-signaling与POD的发生是否存在相关性,为后期的动物实验提供临床线索。第二方面为动物研究,通过多种转基因的模式小鼠联合AAV-Cre病毒注射的方法对小鼠中枢海马内的IL-6Classic-signaling和Trans-signaling进行区分,探讨IL-6 Trans-signaling在PND中的作用。利用免疫荧光和ELISA分析细胞内IL-6 Trans-signaling下游信号蛋白和分子的表达情况,阐述中枢及海马内IL-6 Trans-signaling对外周创伤导致认知功能改变的潜在机制。为临床改进PND治疗措施提供理论基础,为PND预防和治疗治疗药物的开发提供靶点,从而改善患者的术后恢复和减轻社会负担。研究方法:1.临床研究采用前瞻性纵向观察的研究设计,选择年龄≥60岁,在全身麻醉下行择期较大下肢手术的患者。分别采集术前和术后第1天到术后第4天的患者外周静脉血液,用于测量血清白细胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素2（Interleukin-2,IL-2）、白细胞介素4（Interleukin-4,IL-4）、IL-6、s IL-6R、白细胞介素10（Interleukin-10,IL-10）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）。使用意识模糊评估法来评定术后谵妄,每天评估两次,持续四天。根据术后是否发生谵妄将患者分为两组,采用广义线性混合模型进行分析两组患者血清细胞因子的差异。将具有差异的细胞因子围术期变化轨迹采用组基发展轨迹模型（Group-based trajectory modeling,GBTM）进行群组分析。2.动物研究首先利用C57/BL6小鼠建立胫骨骨折术后和外周腹腔注射IL-6后认知功能障碍的模型,检测中枢内IL-6和s IL-6R表达情况,进一步观察侧脑室注射IL-6对认知功能的影响。第二部分为基于IL-6Rαflox/flox和CAMKⅡ-Cre转基因的小鼠,特异性敲除海马CA1区域神经元的IL-6R,探讨IL-6 Classic-signaling在外周创伤和中枢IL-6诱导的认知功能下降中的作用。第三部分为基于IL-6Rαflox/flox和CX3XR1-Cre转基因的小鼠特异性敲除小胶质细胞的IL-6R,探讨IL-6Trans-signaling在外周创伤和中枢IL-6诱导的认知功能下降中的作用。第四部分将利用IL-6R-/-小鼠,描述IL-6 Trans-signaling在外周创伤导致的术后认知功能障碍中的作用。最后对gp130flox/flox转基因小鼠进行AAV-CAMKII-Cre病毒注射特异性敲除gp130实现海马CA1区域特意敲除IL-6 Trans-signaling,同时利用IL-6Trans-signaling特异性阻断剂重组糖蛋白130（Soluble Glycoprotein 130,sgp130Fc）,基于基因和药理手段探讨中枢IL-6 Trans-signaling在外周创伤导致术后认知功能障碍中的作用。实验中基于场景恐惧试验进行小鼠行为学评定,利用PCR、western blot和流式细胞仪对基因模型动物小鼠进行鉴定,通过ELISA剂盒检测IL-6和s IL-R6在中枢的表达情况,采用免疫荧光法染色p STAT3了解IL-6 Trans-signaling信号在海马CA1区域的表达情况。研究结果:1.临床研究一共纳入188名患者,其中有129名符合条件并且接受了手术,126名参与者具有完整的谵妄评估数据,完成了最终分析。126名患者中有31名（24.6%）发生了术后谵妄。采用广义线性混合模型（Generalized Linear Mixed Model,GLMM）对血清细胞因子进行纵向分析发现,发生术后谵妄的患者IL-6和s IL-6R高于未发生术后谵妄的患者。组基发展轨迹模型分析结果显示采用两簇模型（稳定的低水平和波动的高水平）是IL-6和s IL-6R围术期变化轨迹在统计学上最合适的模型。围术期经历波动的高水平IL-6的患者更容易发生谵妄。同样,围术期经历波动的高水平s IL-6R的患者也倾向于发生谵妄。2.基于基因模式动物的基础研究,行为学和分子生物学结果显示:（1）.在手术和外周给予IL-6后小鼠的场景恐惧记忆能力下降,并且伴有小鼠的海马中IL-6表达增加,脑脊液s IL-6R的含量也增加;（2）.侧脑室直接中枢给予IL-6也可导致小鼠的场景恐惧记忆能力下降,在手术和中枢给予IL-6后还伴有海马CA1区p STAT3阳性细胞数增加,在中枢使用IL-6R非特异性阻断剂BE0047,可以阻断手术创伤和IL-6导致的场景恐惧记忆能力下降;（3）.特异性敲除小鼠CA1区神经元IL-6Rα,实现海马CA1神经元Classic-signaling阻断,手术和中枢给予IL-6后还可诱发小鼠场景恐惧记忆能力下降,并且同样伴有CA1区神经元的p STAT3表达增加;（4）.特异性敲除小鼠小胶质细胞IL-6Rα后,实现中枢Trans-signaling阻断,手术创伤可诱导小鼠的场景恐惧记忆下降和CA1区神经元的p STAT3表达增加,而中枢给予IL-6不能引起场景恐惧记忆和CA1区神经元的p STAT3表达的变化;（5）.对IL-6R-/-小鼠中枢使用特异性IL-6 Trans-signaling激活剂Hyper IL-6可导致小鼠的场景恐惧记忆能力下降和CA1区p STAT3阳性细胞数增加,而手术和IL-6并不能诱发这一现象;（6）.在中枢使用IL-6 Trans-signaling特异性阻断剂sgp130,可以阻断手术创伤和IL-6导致的场景恐惧记忆能力下降及CA1区神经元的p STAT3表达增加;（7）.特异性敲除海马CA1区域神经元gp130,实现海马神经元IL-6Trans-signaling缺失后,手术创伤、中枢给予IL-6或者Hyper IL-6都不能诱导小鼠的场景恐惧记忆能力下降和CA1区p STAT3阳性细胞数增加。研究结论:1.与未发生POD的患者相比,发生POD的患者会伴有循环中IL-6和s IL-6R升高,IL-6/s IL-6R复合物形成预示着IL-6 Trans-signaling的强化,提示IL-6Trans-signaling的下游效应细胞可能参与介导POD的发生与发展。此外,在围术期IL-6和s IL-6R的组合升高可能成为术后谵妄发生的血清标志物。2.通过利用多种转基因小鼠的研究,证实了中枢IL-6 Trans-signaling参与介导外周创伤导致的术后认知功能障碍,并且中枢内特异性激活IL-6 Trans-signaling也可导致小鼠认知行为的改变。此外,海马CA1区神经元的IL-6 Classic-signaling并不参与外周创伤导致的小鼠场景恐惧记忆下降。在外周炎症时,可能会伴有循环s IL-6R进入中枢神经系统,为IL-6进行反式信号转导提供可能。