论文部分内容阅读
[目 的]明确IL-35在风湿性心脏病二尖瓣狭窄瓣膜中的表达定位;探寻调节性T细胞（Regulatory T cells,Treg）或调节性 B 细胞（Regulatory B cells,Breg）分泌白介素（Interleukin,IL）-35与风湿性心脏瓣膜病瓣膜狭窄程度是否相关;为进一步探索调节性细胞因子IL-35在风湿性心脏病进展过程中的作用提供依据。[方法]在实验中,采集以风湿性二尖瓣狭窄（Rheumatic mitral stenosis,RMS）为主要病变的风湿性心脏瓣膜病（Rheumatic heart valve disease,RHD）患者外周静脉血,依据二尖瓣狭窄程度分为中度、重度二尖瓣狭窄两组及以健康者静脉血为对照组,分别为22例、15例和20例,所有患者均行二尖瓣瓣膜置换手术。应用流式细胞技术,比较实验组和对照组外周静脉血中调节性T细胞（Treg）细胞和Breg细胞以及分泌IL-35的Treg细胞和Breg细胞的比例变化趋势。另外,收集患者术后置换下的病变瓣膜,应用免疫荧光共聚焦技术明确IL-35在风湿性心脏病二尖瓣狭窄瓣膜中的表达定位。[结 果]在风湿性心脏病患者免疫荧光共聚焦染色中,运用核酸染料DAPI进行细胞核染色,相应的EBI3免疫荧光染料和p35免疫荧光染料进行染色后,在100×的荧光共聚焦显微镜进行观察,可以发现EBI3亚基被特异性染成红色,p35亚基被特异性染成绿色,而细胞核则被染成蓝色。可以看到EBI3和P35染料所染成的两种荧光颜色同时在同一组织部位完全重合呈现为黄色。这说明由EBI3和p35两个亚基组成的IL-35存在或表达于瓣膜组织。分泌IL-35的Treg细胞百分率三组之间有统计学差异（P=0.01<0.05）,重度狭窄组（n1=22）和中度狭窄组（n2=15）分别与对照组（n=20）比较是显著升高的（均值±标准差分别为:0.52±0.51,0.41±0.37,0.10±0.05）,P值分别为P1=0.003＜0.05,P2=0.005<0.05,有统计学差异;而重度组与中度组比较,P>0.05,无统计学差异;运用Spearman’s相关分析分泌IL-35的Treg细胞占淋巴细胞的百分率与瓣膜变程度之间的相关性（P=0.0009<0.001）,表明分泌IL-35的Treg细胞与瓣膜狭窄程度存在显著正相关关系;分泌IL-35的Breg细胞百分率三组之间有统计学差异（P=0.001<0.05）,重度狭窄组（n1=22）和中度狭窄组（n2=15）分别与对照组（n=20）比较是显著升高的（均值士标准差分别为:0.12±0.06,0.14±0.11,0.04±0.02）,P值分别为P1=0.001＜0.05,P2=0.003<0.05,有统计学差异;而重度组与中度组比较,P＞0.05,无统计学差异;运用Spearma n’s相关分析分泌IL-35的Breg细胞占淋巴细胞的百分率发现（P=0.0002<0.001）,分泌IL-35的Breg细胞与瓣膜狭窄程度之间也存在正相关关系。分泌IL-35的T reg细胞与分泌IL-35的Breg细胞比值百分率,无统计学差异。Treg细胞中分泌IL-35的Treg细胞的百分率三组之间有统计学差异（P=0.001＜0.05）,重度狭窄组（n1=22）和中度狭窄组（n2=15）分别与对照组（n=20）比较是显著升高的（均值±标准差分别为:32.72±21.10,29.61±15.87,8.88±3.47）,P值分别为P1=0.001＜0.05,P2=0.002<0.05,有统计学差异,而重度组与中度组比较（P＞0.05）,无统计学差异;同时,运用Spearman’s相关分析Treg细胞中分泌IL-35的Treg细胞的百分率与瓣膜狭窄程度之间的相关性（P＜0.0001）,发现Treg细胞中分泌IL-35的Treg细胞的百分率与瓣膜狭窄程度之间成正相关关系;淋巴细胞中Treg细胞的百分率,无统计学差异。Breg细胞的百分率三组之间有统计学差异（P=0.02<0.05）,重度狭窄组（n1=22）和中度狭窄组（n2=15）分别与对照组（n=20）比较是显著升高的（均值±标准差分别为:0.57±0.31,0.50±0.27,0.30±0.17）,P值分别为P1=0.002<0.05,P2=0.032<0.05,有统计学差异,而重度组与中度组比较（P＞0.05）,无统计学差异;运用Spearman’s相关分析Breg细胞占淋巴细胞的百分率与瓣膜狭窄程度之间的相关性（P=0.0004<0.001）,发现Breg细胞与瓣狭窄程度成正相关关系;分泌IL-35的Breg细胞百分率三组之间有统计学差异（P=0.001<0.05）,重度狭窄组（n1=22）和中度狭窄组（n2=15）分别与对照组（n=20）比较是显著升高的（均值±标准差分别为:0.12±0.06,0.14±0.11,0.04±0.02）,P值分别为P1=0.001<0.05,P2=0.003<0.05,有统计学差异,而重度组与中度组比较（P＞0.05）,无统计学差异。运用Spearman’s相关分析分泌IL-35的Breg细胞占淋巴细胞的百分率与瓣膜狭窄程度之间的相关性（P=0.0002<0.001）,发现分泌IL-35的Breg细胞与瓣膜狭窄程度之间成正相关关系。CD4+T细胞百分率三组之间有统计学差异（P=0.001<0.05）,重度狭窄组（n=22）和中度狭窄组（n=15）分别与对照组（n=20）比较是显著升高的（均值士标准差分别为:46.02±13.58,44.02±12.91,33.29±5.74）,P值分别为P 1=0.001<0.05,P2=0.024<0.05,有统计学差异,而重度组与中度组比较（P＞0.05）,无统计学差异;同时,运用Spearman’s相关分析CD4+T细胞百分率与瓣膜狭窄程度之间的相关性（P<0.0001）,发现CD4+T细胞与瓣膜狭窄程度之间成正相关关系。[结 论]通过免疫荧光共聚焦,明确在RMS瓣膜组织中有IL-35的表达。在RMS患者外周血中,IL-35由Treg细胞和Breg细胞共同分泌,在病变发展过程中表达量均增加,不以其中一方为主导。且由此推测细胞免疫和体液免疫共同参与了RMS疾病的进展过程。分泌IL-35的Treg细胞与RMS病变进程的免疫应答呈正相关,但不是通过增加Treg细胞表达量在RMS病变进展发挥作用;分泌IL-35的Breg细胞与RMS病变过程免疫应答呈正相关;在RMS患者外周血中,C D4+T细胞与风湿性RMS程度呈正相关。说明CD4+T在RMS的病情进展中起作用。