论文部分内容阅读
有机阴离子转运多肽（Organic anion transporting polepeptides，OATPs)属于溶质转运体（Solute carrier，SLC)超家族，是一类重要的药物摄取转运体。按照氨基酸序列的同源性它们被分为6 个亚家族。OATPs是一类多特异性的转运体，它们介导非钠离子依赖的广泛的两亲有机溶质的转运，包括胆汁盐、类花生酸、有机染料、甾体激素缀合物、甲状腺激许多药物和其他外源性物质。其中0ATP1B1与0ATP1B3是该类转运蛋白的重要成员，它们主要分布在人肝细胞膜的基底外侧膜上，在肝细胞的药物清除中发挥重要作用。 0ATP1B1与0ATP1B3包含12个跨膜区，且两者的同源性高达80% ，因此两者在结构与功能方面具有很大的相似性。其中雌酮-3-硫酸酯（Estrone-3-sulfate，E3S)是OATP1B1与 OATP1B3共同的底物。然而当儿茶素类化合物表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG)与E3S 同时给药时，EGCG能激动 OATP1B3对E3S的摄取，但是却抑制OATP1B1对E 3 S的摄取。有文献报道OATP1B3可被其他小分子激动，但对小分子激动OATP1B3的分子机制研究目前并没有文献报道。因此本论文的主要研究目标即是确定OATP1B3中哪些结构域和氨基酸残基对小分子的激动起重要作用，为此我们构建了 OATP1B3的12个嵌合蛋白，即OATP1B3的12个跨膜区域分别用OATP1B1对应的部分进行替换。功能研究结果表明，当OATP1B3的TM1和TM10被OATP1B1对应的部分替换时，小分子调节剂EGCG对OATP1B3的激动作用显著降低，甚至呈现抑制的趋势。以上结果表明，TM1与 TM10这两个跨膜区是对小分子的激动起重要作用的结构域。 将OATP1B1与OATP1B3在TM1的氨基酸序列进行比对发现，两者在TM1有五个氨基酸不同。为了进一步确定哪几个氨基酸是起主要作用的，我们将OATP1B3中的五个氨基酸残基分别突变为OATP1B1中对应的氨基酸残基，得到OATP1B3-F27L、F36L、Y38F、A42T和G45A五个单突变蛋白。功能研究表明，当0ATP1B3在 4 5位的氨基酸由柔性最大的甘氨酸突变成丙氨酸时，小分子调节剂EGCG对0ATP1B3的激动作用显著降低。类似地，0ATP1B3在TM10有 14个氨基酸与0ATP1B1不同，通过定点突变，我们得到了14个单突变蛋白，分别为0ATP1B3-N528D、T529A、F535Y、I536F、Y537F、I543L、S545L、L546F、T550L、T554S、F555H、I556V、L557M和T559I。功能实验表明，当OATP1B3在555位的氨基酸由芳香族苯丙氨酸突变成带正电荷的组氨酸时，激动作用显著降低。因此在野生型0ATP1B3转运体中4 5位的甘氨酸以及555位的苯丙氨酸是对小分子E G C G的激动起主要作用的氨基酸残基。 为了进一步将确定45和555位点氨基酸结构特征对0ATP1B3激动的影响，我们将45位柔性最大的甘氨酸分别突变成含有羟基的丝氨酸、芳香族的苯丙氨酸、带负电的天冬氨酸、带正电的赖氨酸，得到1B3-G45S，1B3-G45F,1B3-G45D，1B3-G45K；同样类似地，将555位的苯丙氨酸突变成芳香族色氨酸与酪氨酸，得到1B3-F555W，1B3-F555Y。功能实验表明，当45位的甘氨酸突变成以上氨基酸时，小分子调节剂EGCG对0ATP1B3的激动作用也是显著降低的，说明45位的甘氨酸柔性可能是发挥激动作用的关键因素。当555位芳香族的苯丙氨酸突变成带正电荷组氨酸时，EGCG对0ATP1B3的激动显著降低，而当555位的苯丙氨酸突变成不带电荷的芳香族氨基酸色氨酸与酪氨酸时，EGCG对0ATP1B3仍起激动作用。以上结果表明，555位的正电荷不利于0ATP1B3的激动。