目的:在中国,肺癌的发生率正在持续增加,它的出现给每个家庭带来了巨大的经济负担,不仅如此,它也引起了社会的负担。在过去的几十年里,非小细胞肺癌（NSCLC）以及小细胞肺癌已经成为肺癌诊断的常用术语。近几年,已经发现了一些致癌机制,例如EGFR突变,ALK融合等,这些致癌基因已经成为非小细胞肺癌治疗的主要靶标。但是,肺癌的早期诊断以及治疗的方法依旧是有限的,肺癌的死亡率在恶性肿瘤中依旧是最高的。尽管分子治疗,以及免疫治疗已经运用到非小细胞肺癌的治疗当中,但是改进并制定新的治疗方案,发现新的治疗靶点依旧十分重要。根据基因表达谱交互式数据库（GEPIA）得到的数据显示,非小细胞肺癌中,Kelch样蛋白18（KLHL18）在非小细胞肺癌中低表达,在正常的肺泡和肺支气管中表达较高。这可以预示,KLHL18在非小细胞肺癌中可能作为抑癌因子而存在。KLHL18（kelch-like 18）蛋白是kelch家族42名成员中的一员,Kelch家族中,已经有四名成员与肿瘤有明确关系,他们是KLHL6,KEAP1（KLHL19）,KLHL20和ENC1（KLHL37）。KLHL6是弥漫性大B细胞淋巴瘤的抑癌基因;KEAP1在多种癌中可以通过活性氧的堆积,发挥肿瘤抑制作用;KLHL20以及ENC1均可以通过泛素蛋白酶体途径影响肿瘤细胞的自噬功能。作为同一家族成员的KLHL18蛋白在肿瘤中的作用尚未报道,KLHL18有三个结构域,分别是BTB/POZ,BACK,还有六个Kelch重复序列。KLHL家族蛋白N末端的BTB结构域促进蛋白质与蛋白质之间的结合,BACK结构域没有具体的功能,在细胞外功能方面,还有细胞形态方面,以及蛋白和蛋白之间的结合方面都有很大作用的序列是碳末端的Kelch重复序列。据报道,KLHL18蛋白可以通过BTB结构域与Cullin-3蛋白（E3泛素连接酶体复合物的骨架蛋白）结合,使Aurora-A蛋白发生泛素化,并在工具细胞中调节有丝分裂的进程。Cullin-ring连接酶（CRL）是一个多亚基的E3泛素连接酶复合物,可募集底物特异性衔接子,来催化底物蛋白质发生泛素化。CUL3蛋白可以特异性识别带有BTB结构域的蛋白,并与该蛋白形成复合物后,靶向底物。细胞中,蛋白主要减少的途径之一是泛素途径,且机制相对较为成熟,泛素蛋白酶体途径对肿瘤细胞的功能存在很大的影响。作为泛素蛋白酶体复合物其中一员的KLHL18蛋白是否仅有Aurora-A蛋白一种底物,KLHL18在肿瘤细胞中是发挥何种作用,这是一个值得研究的问题。在Kaplain-Meier数据库中,我们发现KLHL18的低表达与肺癌患者的不良预后相关（P<0.05）,并结合GEPIA数据库的结果,我们推测KLHL18可能成为非小细胞肺癌的治疗靶点。迄今为止,KLHL18在非小细胞肺癌中的作用情况还不知道。因此,我们研究了KLHL18在人非小细胞肺癌组织以及细胞中的表达情况,以及KLHL18在非小细胞肺癌中的作用机制,目的在于为非小细胞肺癌的治疗提供新的方案。研究方法:1.本研究首先利用GEPIA数据库了解KLHL18在肺腺癌（LUAD）以及肺鳞癌（LUSC）的表达情况,而后用Kaplan-Meier生存分析,探究了KLHL18在肺癌中的预后情况。2.接下来,本研究对214例临床非小细胞肺癌的组织样本进行了免疫组化实验。免疫组织化学实验染色根据“两步法”进行。染色过后,再由两名独立研究人员根据双盲的规则,随机评估组织切片的染色强度和染色细胞的百分比,而后进行显色评分。根据细胞着色占细胞总数的百分比,KLHL18的表达分为五个水平:0（无着色）,1（1%-25%）,2（26%-50%）,3（51%-75%）和4（76%-100%）。根据细胞染色的强度,KLHL18的表达又分为4个水平:0（无色）,1（淡黄）,2（黄色）和3（棕色）。定义KLHL18得分大于4的样本为有表达;评分为1-4（包含4分）视为弱表达,而评分为0视为不表达。样品评分是这样的:着色面积分数乘以着色强度分数。3.本研究使用了两种非小细胞肺癌的细胞系（NCI-A549和NCI-H1299）作为整个实验的细胞模型进行体外实验。NCI-A549和NCI-H1299均在含有10%胎牛血清的1640中进行培养。这两种细胞均在5%CO2的孵箱中,生长环境的温度为37℃。4.利用Lipofectamine 3000试剂进行细胞系中目的蛋白含量的调控,根据制造商的说明书对所选定的细胞进行瞬时转染。转染后72小时收取蛋白样,检测转染效率,而后用G418抗生素进行细胞系稳定转染的筛选,10-14天后,生存下来的细胞进行培养,再用有限稀释法获得稳定转染的A549和H1299细胞,Western blot实验以及细胞功能学实验均用稳定转染的这两种细胞系进行。5.利用MTS试剂盒分析评估体外细胞增殖能力。铺5个96孔板,每个孔中含有3000个细胞,这些细胞是上调或者下调KLHL18表达量的细胞,每个孔中加入10%FBS。接下来,每天在每个孔中加入试剂盒中的试剂,用来测定每个孔中的细胞活力。用锡纸包上96孔培养板进行避光处理,条件为37℃,无菌孵箱孵育1小时,而后使用酶标仪在490 nm波长下测量每个孔的吸光度值。最后用Graph Pad Prism 5.0软件进行P值的计算以及细胞增殖活力图的描绘。6.以800个细胞/孔的密度将实验组或对照组细胞接种在无菌的无菌板中。在孵箱中孵育10天,孵箱的条件为正常培养细胞的条件,用PBS洗涤细胞3次,洗完后,接下来用预冷的冰甲醇进行细胞固定10分钟,用PBS溶液再次洗涤细胞3次,然后用结晶紫溶液染色10分钟。用Image J软件进行拍摄取图,然后进行集落数的统计,≥50个细胞时视为集落。最后用Graph Pad Prism 5.0软件进行P值的计算。7.利用铺有基质胶的Transwell小室进行细胞侵袭能力的测定。首先将进行细胞侵袭实验的小室放入适当大小的无菌培养板中,然后配置实验用的基质胶,配置比例为基质胶:无血清1640为1:7,每个Transwell小室中加入100微升的基质胶溶液,放入37℃二氧化碳含量为5%的孵箱中,进行过夜处理。第二天,在Transwell小室的上室中加入100微升含有5*104个稳转细胞的悬浊液,再次在37℃,5%CO2的孵箱中孵育24h,取出穿过细胞的小室,PBS洗涤3次,再用预冷的冰甲醇进行细胞固定10分钟,用PBS溶液再次洗涤细胞3次,然后用结晶紫溶液染色。待小室晾干后,用显微镜进行拍照取图,并进行计数统计。8.用划痕实验检测细胞的迁移能力。等到细胞在六孔板中刚刚长满的时候,就可以进行实验了。将细胞中加入丝裂霉素,并在无菌培养箱中,避光且37℃的条件下孵育2 h。接下来,用100μL移液器吸头刮单层细胞,做“井”字形处理。用PBS轻轻洗涤,并除去没有粘附在细胞培养板中的细胞,将细胞在血清中连续培养规定的时间,并在显微镜下拍摄处理过的细胞。拍取图片,并用PS软件测定细胞迁移的距离,最后用Graph Pad Prism 5.0软件进行P值得计。9.本研究用q PCR实验进行相关基因m RNA水平的检测,用Trizol法进行指定细胞的m RNA的提取,q PCR的实验方法按照试剂商说明书进行。同时也用Western Blot实验进行相关蛋白的蛋白水平的检测。首先用适量的蛋白裂解液将目的细胞进行裂解,裂解液的体积与细胞的体积比为3:1-4:1。并在蛋白裂解液中加入适量的磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂（裂解液:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=1:1:1）。取35μg质量的蛋白样品加入到SDS-PAGE胶中进行实验。10.质谱分析实验用来筛选非小细胞肺癌中可以与KLHL18结合的蛋白质。将感兴趣的细胞接种到10cm培养皿中,待细胞长满后,收集目的细胞,用细胞裂解液裂解20分钟,并在4℃,12,000 rpm条件下离心15分钟。接下来,将60μL蛋白质A/G磁珠添加到收集的上清液中,然后4摄氏度孵育2小时。然后将样品在4℃下以1,000 rpm离心5分钟,离心后将上清液均匀分成两部分,分别放入到两个EP管中。然后,将4微克所示目标抗体或抗小鼠Ig G加入上清液中,于4℃孵育过夜。接下来,将25μL琼脂糖A/G磁珠添加到每个样品中,然后在4℃下孵育6小时。然后将样品用裂解缓冲液洗涤3次,最后煮沸10分钟以制备样品。然后将样品加入到10%SDS-PAGE中。凝胶用考马斯亮蓝染色,选取与Ig G组胶有差异的区域,添加到Q-Exactive质谱仪中进行检测,MS/MS扫描范围为50-2200m/z。通过数据软件分析峰值,然后执行Moscot搜索以找到匹配的蛋白质。11.我们利用免疫荧光实验进行细胞中蛋白质与蛋白质是否共定位。将适量的细胞在玻璃底的共聚焦实验无菌皿中进行培养,在37℃,CO2含量为5%的无菌孵箱中培养。从孵箱中取出培养皿后,先用PBS清洗3次,然后进行细胞固定,固定细胞用的试剂是4%多聚甲醛,固定细胞15分钟,然后打孔,打孔的试剂为0.1%Triton X-100,打孔10分钟。将细胞再次用PBS洗涤3次后,用3%牛血清白蛋白封闭2 h,并与一抗在4℃条件下孵育过夜。第二天,将抗体吸出,吸出抗体后抗体可以冻存保留,然后用PBS洗3次,洗干净后,孵二抗2小时,温度室温就可以。用PBS洗涤细胞3次,并用DAPI进行细胞核染色10分钟。最后使用共聚焦显微镜进行成像。12.免疫共沉淀实验（Co-IP）用来确定细胞内蛋白质-蛋白质间是否发生相互作用。将感兴趣的细胞系接种在两个10cm培养皿中。当细胞长满时,用蛋白裂解液将细胞裂解,并在4℃下以12,000 rpm条件离心15分钟。收集上清液用于进行Co-IP实验,并将60μL Protein A/G磁珠添加到上清液中封闭2 h;然后将上清液在4℃,1,000 rpm条件下离心5分钟,然后将上清液平均分为两部分,分别加入4–10μg的目标抗体和抗小鼠/兔Ig G,并将抗体在4℃层析柜中振摇过夜。第二天,将25μL琼脂糖A/G磁珠添加到这两部分上清液中,并在4℃下孵育6 h,然后用细胞裂解液冲洗磁珠3遍,并将EP管在沸水中加热10分钟,然后进行免疫印迹实验。13.在进行了Co-IP实验后,我们又进行了泛素化实验以研究KLHL18蛋白在非小细胞肺癌细胞中的作用机制。用Ub-HA质粒转染稳定转染的细胞系,并在收样前在细胞中加入26S蛋白酶体抑制剂,抑制剂的浓度为18.5μM,在细胞的培养基中存留24小时。然后收取细胞,进行蛋白裂解,通过离心收集蛋白复合物,然后加入目的一抗,并将抗体在4℃层析柜中振摇过夜。第二天,将20μL琼脂糖A/G磁珠添加到上清液中,并在4℃下孵育6 h,然后用细胞裂解液冲洗磁珠,并将EP管在沸水中加热10分钟,然后进行免疫印迹实验.14.本研究也使用了很多抑制剂。MG-132是一种常见的蛋白酶体抑制剂,可以有效防止26S蛋白酶体的水解,该抑制剂以18.5μM的浓度处理目的细胞24小时。MLN4924可以选择性抑制NEDD8激活酶的活性,在CUL3蛋白的碳末端,存活着NEDD8激活酶,这种酶可以通过多种修饰途径激活CRL,将其以0.3μM的浓度处理目的细胞24小时。LY294002是PI3K信号通路的广谱抑制剂,以40 m M的浓度添加到目的细胞24小时。雷帕霉素是一种特异性的mTOR抑制剂,其作用浓度为15 n M,添加时间为12小时。15.使用SPSS 24.0和Graph Pad Prism 5来分析所有数据。运用χ2检验来评估临床病理因素与KLHL18表达之间的相关性。在相同条件下,所有的实验都是进行3次重复实验。结果:1.通过GEPIA数据库的查询,我们了解到KLHL18在非小细胞肺癌组织中的表达较正常肺组织低,同时通过Kaplan-Meier数据库,可以了解到KLHL18的低表达与肺癌患者的不良预后相关。不仅如此,KLHL18的低表达同时与乳腺癌患者、肾乳头细胞癌患者、头颈部鳞状细胞癌患者以及直肠腺癌患者的不良预后相关。说明KLHL18是多种癌的潜在的预后评估指标。2.进行214例免疫组织化学实验,发现其中128例组织样本中KLHL18蛋白表达含量较高,86例组织样本中KLHL18蛋白表达较低或者是不表达。通过SPSS统计学分析,我们了解到KLHL18的表达与淋巴结转移（P<0.0001）,肿瘤大小（P=0.037）和TNM分期（P=0.019）均相关,并呈现负向相关趋势（R<0）。在使用定量聚合酶链反应（q PCR）检查了22对非小细胞肺癌和癌旁组织中KLHL18的表达后,发现癌旁组织中KLHL18的表达明显高于癌组织,这与免疫组织化学结果一致。在这214例临床样本中,有37例样本带有预后分析,我们将这37例临床样本进行SPSS统计学分析后,发现KLHL18的低表达与患者的不良预后相关,并且,经过COX回归分析,可以了解到,KLHL18作为独立危险因素影响着非小细胞肺癌患者的生存期,代表统计学的P值小于0.05,因此这个结论是有意义的。3.进行了细胞功能学实验后,发现沉默的KLHL18可以促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。在上调了KLHL18蛋白的表达量后,得到了相反的结果,即KLHL18的表达升高后,非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭能力受到抑制。4.通过质谱分析实验,我们可以了解到KLHL18蛋白可以与PI3Kp85α蛋白在非小细胞肺癌细胞中结合,并且可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,KLHL18可以通过这个经典通路抑制非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭能力。5.KLHL18蛋白不仅可以通过抑制PI3K\AKT\mTOR信号通路抑制非小细胞肺癌的行为,同时可以通过这个通路抑制PD-L1蛋白的表达,进而调控非小细胞肺癌的免疫微环境。6.KLHL18可以通过形成CRL复合物,参与并促进PI3Kp85α蛋白的泛素化进程。7.KLHL18-ΔBTB结构域是KLHL18发挥肿瘤抑制作用十分重要的结构域。它的缺失可以有效的抑制KLHL18蛋白在非小细胞肺癌中的肿瘤抑制作用。结论:1.KLHL18是非小细胞肺癌患者的潜在的预后评估生物标志物。2.KLHL18在非小细胞肺癌中发挥抑癌作用。3.KLHL18可以通过参与并促进PI3Kp85α蛋白泛素化进程发挥肿瘤抑制作用。4.KLHL18可以通过PI3K/AKT/mTOR经典通路抑制PD-L1蛋白的表达。5.KLHL18可以参与非小细胞肺癌免疫微环境的调控。