目的:肌腱是连接骨骼肌和骨骼的致密结缔组织。肌腱损伤是一种常见的骨科疾病,由创伤、年龄相关性退行性变或过度使用等原因引起。虽然随着手术技术和术后活动的增加,肌腱粘连的发生减少,但它仍是肌腱损伤修复术后的主要并发症,常常导致疼痛、关节活动受限、甚至需要再次手术。肌腱来源的脱细胞基质具有天然肌腱的成分、良好的生物相容性和低免疫原性。因此本研究试图利用肌腱脱细胞基质材料制备防粘连膜解决肌键损伤后粘连的问题。1.评估优化的肌腱脱细胞方法的脱细胞效果,以及新鲜肌腱、脱细胞肌腱和肌腱防粘连膜的理化性质。2.通过细胞毒试验、溶血试验和细胞亲和性试验检测防粘连膜在体外的生物相容性。3.通过将防粘连膜植入大鼠背部皮下,检测防粘连膜的体内降解性与免疫反应。4.通过将防粘连膜作用于肌腱来源细胞,检测细胞水平上防粘连膜对肌腱的影响。5.动物实验分析肌腱防粘连膜在防止粘连方面的效果。方法:优化肌腱的脱细胞方法并通过对新鲜组肌腱和脱细胞肌腱进行HE染色、DNA定量和琼脂糖电泳,从而对肌腱脱细胞的效果进行验证。通过对新鲜组肌腱和脱细胞肌腱进行横切片的Masson染色对肌腱切片中的组织成分进行定性分析,对干重情况下的新鲜组肌腱和脱细胞肌腱组织的胶原蛋白含量和糖胺聚糖含量进行检测,以此检测脱细胞方法对于肌腱组织的影响。用肌腱的脱细胞基质材料制备肌腱防粘连膜,并通过扫描电镜对防粘连膜的孔隙进行检测。通过蛋白质组学对新鲜肌腱、脱细胞肌腱和防粘连膜中的蛋白成分进行提取和分析。通过细胞毒试验、溶血试验和细胞亲和性试验检测防粘连膜在体外的生物相容性。通过将防粘连膜植入大鼠背部皮下囊中,然后进行HE染色和免疫荧光,从而检测膜的体内降解性与免疫反应。通过PCR检测膜对肌腱来源细胞的影响。膜被用于兔子跟腱损伤修复实验,横切片,然后进行HE染色、Masson染色、粘连评分和踝关节屈曲度,从而评价肌腱防粘连膜在防止粘连方面的效果。结果:HE染色、DNA定量和琼脂糖电泳显示,利用微切片技术优化的脱细胞方法能有效脱细胞。具体的就是,经过HE染色的脱细胞基质组织切片中未见到细胞核;在琼脂糖凝胶电泳的DNA定性实验中,脱细胞基质中没有残留明显的DNA片段;在双链DNA（dsDNA）定量实验中,干的脱细胞基质中双链DNA的含量为40.46±4.58 ng/mg,小于50 ng/mg。脱细胞后,脱细胞基质的整体结构与自然组织相似,但脱细胞基质结构更疏松,有许多孔洞。Masson染色显示脱细胞基质和自然组织均由胶原纤维组成。干态的脱细胞基质和自然组织中胶原含量分别为915.26±42.75 μg/mg 和 926.91±19.28 μg/mg,两组间无显著性差异（P>0.05）,说明脱细胞过程中胶原蛋白没有明显损伤。脱细胞基质与正常组织糖胺聚糖含量分别是0.96±0.04 μg/mg和0.97±0.03 μg/mg,无显著性差异（p>0.05）。肌腱防粘连膜在湿态为白色、不透明,在干燥状态下为无色和透明。扫描电镜结果显示,肌腱防粘连膜的结构均匀致密,无可见的孔隙。蛋白组学的结果表明,脱细胞前后的肌腱组织和肌腱防粘连膜中,均存在COL1A1、COL2A1等多种胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白等众多的结构蛋白,而且新鲜肌腱组织经过脱细胞处理,这些结构蛋白在总蛋白中的相对含量升高,这种现象可以被认为是由于脱细胞去除了组织中的细胞相关蛋白质,致使细胞外基质中的结构蛋白质被进一步提纯;而新鲜肌腱组织经过脱细胞处理,组织中的色素上皮衍生因子（PEDF）、血管性血友病因子、血管生成素样等生长因子,在总蛋白中的相对含量降低,这说明生长因子在脱细胞过程中有损失。脱细胞基质制备成膜的过程中,有41种蛋白质的相对含量增高,40种蛋白质的相对含量降低,相对于1381种被检测到的蛋白质总数,它们所占比例较小,这表明肌腱防粘连膜的制备条件相对温和。体外生物相容性试验包括细胞毒性试验、溶血试验和细胞亲和性试验。细胞毒性试验表明,肌腱防粘连膜作用于L929细胞,在1天内的相对增殖率高于100%,从第1天到第3天,细胞的相对增殖率逐渐降低,接近100%,这说明肌腱防粘连膜不仅对L929细胞无毒,而且能促进细胞增殖。溶血试验以生理盐水为阴性对照,蒸馏水为阳性对照,肌腱防粘连膜的浸提液组的上层液体透明,与生理盐水组相似,说明肌腱防粘连膜不会引起溶血反应。肌腱来源细胞在肌腱防粘连膜上能充分伸展,细胞形态良好,说明肌腱防粘连膜具有良好的细胞相容性。大鼠皮下植入后,用HE染色法研究肌腱防粘连膜在体内的降解情况,用HE染色法和免疫荧光法研究膜埋植后组织发生的免疫反应。试验中所有大鼠均存活至预定时间点,无并发症。HE染色显示肌腱防粘连膜的形态变化和体内降解性。HE染色后肌腱防粘连膜呈红色条带。大体上,前3周膜的结构无明显变化,第6周开始膜内可见大量细胞,第12周膜己经完全消失。HE染色和免疫荧光法直观地显示膜植入体内后炎症细胞的类型、数量和分布的变化,结果显示,植入后第1周至第12周均未发现巨噬细胞。植入后第1周,细胞膜周围有少量淋巴细胞。在第2周,一些淋巴细胞和大量浆细胞出现在细胞膜周围。在第3周,除了一些浆细胞和淋巴细胞外,在细胞膜周围还发现一些嗜酸性粒细胞。第4周,细胞膜周围可见部分中性粒细胞,浆细胞和淋巴细胞数量明显减少;细胞膜外层有大量浆细胞和淋巴细胞,但细胞膜中层未见细胞。第6周,浆细胞和淋巴细胞逐渐向膜内扩散,膜的周围仍可见嗜酸性粒细胞,但嗜酸性粒细胞数量远少于第3周。第12周未发现肌腱防粘连膜残留,所有炎症细胞消失,肌腱防粘连膜组与对照组无显著性差异,说明肌腱防粘连膜是一种较安全的生物材料,不会引起严重的炎症反应和免疫排斥反应。兔子跟腱修复实验结果显示,踝关节屈曲度、粘连评分、机械强度和组织学结果均优于对照组,说明防粘连膜能有效防止肌腱修复术后粘连的发生。结论:以异种细胞外基质为原料,采用优化的肌腱脱细胞方法,获得肌腱脱细胞基质,并成功地用肌腱脱细胞基质制备了肌腱防粘连膜（Decellularized Tendon Membrane,DTM）。理化性质、生物学评价、以及兔子跟腱修复实验结果表明,肌腱防粘连膜能有效防止肌腱粘连,展现出巨大的应用潜力。