肺癌是全世界范围内癌症相关性死亡的主要原因。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）则是最常见的肺癌类型,占病例总数的80-85%。手术切除、以铂类为基础的化疗、放疗仍是临床上治疗NSCLC的主要方法。尽管如此,在大多数患者中首次发现该病时,通常处于晚期,总体生存率较低。因此,识别新的致癌或抑癌基因对预防和治疗NSCLC具有重要意义。Wnt信号通路在人类恶性肿瘤中变化显著,现有的研究数据表明Wnt信号通路明显影响着NSCLC的肿瘤发生、预后和治疗耐药性。该信号通路受到大量且复杂的蛋白质阵列的精确调控,其中由降解复合物调控的稳定于细胞质和细胞核中的β-catenin蛋白,在经典型Wnt信号通路级联反应的信号输出中发挥着至关重要的作用。PHLDA3基因编码一个由127个氨基酸组成的小分子蛋白,仅具有一个普列克底物同源（PH）结构域。目前研究中发现,在神经内分泌肿瘤中,PHLDA3通过竞争性结合PIP抑制Akt活性进而发挥抑癌作用。在食管鳞状细胞癌中,PHLDA3低表达并与不良预后相关,而在头颈部鳞状细胞癌中,PHLDA3表达水平显著升高。然而,PHLDA3在肺癌中的生物学作用研究甚少,仍有待完全阐明。目的:1、分析PHLDA3在非小细胞肺癌组织中的表达情况及其与肺癌临床病理因素的关系;2、探讨PHLDA3对Wnt信号通路的调控作用及其影响肺癌增殖、侵袭的分子机制。研究方法:我们收集了2012年至2015年在中国医科大学第一附属医院进行手术切除的206例（平均年龄58岁）NSCLC患者肺癌样本。部分肺癌样本（108例）伴有相应的正常肺组织（离原发肿瘤边缘>5cm）。我们还收集了60对新鲜的原发性肺癌和相应的正常肺组织样本,样本取出后立即冷冻在液氮中,并在-80°C深冻保存。采用免疫组化和免疫印迹法（Western blot）分析肺癌组织中PHLDA3的表达及其与肺癌临床病理因素的相关性。通过转染PHLDA3基因或针对PHLDA3的小干扰RNA调控肺癌细胞中PHLDA3的表达,并通过MTS细胞增殖实验、克隆形成实验、基质胶侵袭实验和划痕实验探讨PHLDA3对肺癌细胞增殖和侵袭的影响;采用免疫印迹法和免疫荧光法检测Wnt信号通路和EMT相关蛋白表达水平的改变。通过免疫共沉淀实验,以及使用Wnt信号通路和GSK3β抑制剂进一步探讨PHLDA3在肺癌细胞中的调控机制。结果:1、PHLDA3在肺癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常肺组织。PHLDA3在肺癌组织中的表达与肺癌患者性别、组织学类型、高TNM分期、淋巴结转移和肿瘤大小显著相关。在60对新鲜肺癌样本中,肺癌组织中PHLDA3的表达水平明显高于相应癌旁正常肺组织标本。2、在H1299和A549肺癌细胞系中上调PHLDA3的表达后,与相应的对照组相比,肺癌细胞的增殖、克隆形成及基质胶侵袭能力明显增强,而敲低PHLDA3表达后得到了相反的结果。3、在H1299和A549细胞中过表达PHLDA3可上调总β-catenin和activeβ-catenin、细胞核内总β-catenin、细胞核内activeβ-catenin,以及p-GSK3β、TCF4、c-Myc、Cyclin D1和MMP7的表达水平,而抑制GSK3β的表达。相反,在H1299和A549细胞中敲低PHLDA3下调了总β-catenin、activeβ-catenin、核内总β-catenin、核内activeβ-catenin以及p-GSK3β、TCF4、c-Myc、Cyclin D1和MMP7的表达水平,却促进GSK3β的表达。4、与相应的对照细胞相比,在H1299和A549细胞中过表达PHLDA3后,N-cadherin、Snail、Twist、ZEB1和MMP9的蛋白表达量显著升高,而E-cadherin、ZO1和Claudin1的蛋白表达量显著降低。相反,敲低H1299和A549细胞中PHLDA3的表达后,N-cadherin、Snail、Twist、ZEB1和MMP9的表达降低,而E-cadherin、ZO1和Claudin1的表达增加。免疫荧光检测也证实PHLDA3促进N-cadherin和vimentin的表达,而抑制ZO1的表达。5、在8对新鲜肺腺癌样本中,PHLDA3的表达水平与activeβ-catenin呈正相关。在H1299和A549细胞中转染PHLDA3基因后,加入Wnt信号通路抑制剂XAV-939逆转了PHLDA3过表达所诱导的activeβ-catenin、p-GSK3β、c-Myc、Cyclin D1、MMP7、N-cadherin、MMP9的表达水平上调;同时逆转了PHLDA3过表达所诱导的GSK3β及E-cadherin表达水平下调。XAV-939也部分逆转了PHLDA3转染对H1299和A549细胞增殖、克隆形成和基质胶侵袭能力的促进作用。6、免疫共沉淀证实了PHLDA3与GSK3β能够相互作用。在敲低PHLDA3的H1299与A549细胞中,加入GSK3α/β抑制剂CHIR-99021,能够逆转敲低PHLDA3所诱导的activeβ-catenin、p-GSK3β、c-Myc、Cyclin D1、MMP7、N-cadherin、MMP9表达水平下调,同时逆转了敲低PHLDA3所诱导的GSK3β及E-cadherin表达水平上调。抑制剂CHIR-99021也部分逆转了敲低PHLDA3表达对细胞增殖、克隆形成和基质胶侵袭能力的抑制作用。结论:1、PHLDA3在肺癌组织中高表达,并与肺腺癌的恶性进展和患者的不良预后相关;2、PHLDA3能够促进肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移;3、PHLDA3能够通过激活Wnt信号通路和EMT来促进肺癌细胞的增殖和侵袭;4、PHLDA3可能通过与GSK3β相互作用来调节Wnt信号活性。