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红曲菌（Monascus spp.）,又称红曲霉,是中国等亚洲国家的传统食用丝状真菌。其发酵产物——红曲,作传统药食两用产品,在中国约有2000年的应用历史。如今,与红曲菌相关的产品已遍布全球,被广泛用于食品和医药行业。研究表明,红曲菌可产生多种有益次级代谢产物（Secondary metabolites,SMs）,例如红曲色素（Monascus pigments）、莫纳可林（Moncolin）K和γ-氨基丁酸等,少数菌株也可能产生一种真菌毒素——桔霉素（Citrinin）。最近的研究发现,红曲菌还可产生γ-内酰胺和β-内酰胺等抗菌物质,例如青霉素G（PenicillinG,PG）,然而关于红曲菌中PG基因簇中各基因的功能及其合成途径尚不清楚。本研究首先以生物信息学软件预测了红色红曲菌（M.ruber）M7中PG基因簇中各基因的功能,并推导出PG的生物合成途径,然后采用分子生物学方法对基因簇中的一些关键基因进行敲除、回补和过表达,并通过分析这些突变菌株的形态特征和SMs变化,分析了这些基因的功能。最后,通过研究突变菌株对PG的3种前体——苯乙酸（PAA）、L-半胱氨酸（L-Cys）和D-缬氨酸（D-Val）,以及部分弱有机酸的敏感性,初步证明在PG基因簇中的一个转移蛋白基因MrAbct可能是特异性负责PAA转运的基因。1.红色红曲菌M7的PG基因簇中各基因功能的预测以anti-SMASH分析预测了红曲菌M7的PG基因簇中各基因功能,发现M7的PG基因簇包含8个基因,编号分别为GME7026-GME7033。其中,第1个基因GME7026是非核糖体肽合成酶（NRPS）基因MrNrps;第7个基因GME7032为聚酮合酶（PKS）基因MrPks。其他基因分别为异青霉素N基因（MrIpns GME7033）、抗性基因（MrArp GME7027）、ABC转运蛋白基因（MrAbct GME7028）、MSF转运蛋白基因（MrMfst GME7029）、加氢还原酶基因GME7031,以及功能未知基因GME7030。2.红色红曲菌M7的PG基因簇中几个重要基因的遗传修饰在PG等真菌SMs的合成基因簇中,PKS基因和NRPS基因对SMs的合成至关重要。由于红曲菌M7的PG基因簇中PKS基因敲除者（ΔMrPks）实验室前期已经获得,所以本研究将选择MrNrps以及MrAbct与MrMfs,共3个基因为研究对象。以double joint-PCR分别构建它们的敲除盒和MrMfst回补盒,并以双酶切法构建载体,以根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导,将这些载体分别转化至红曲菌M7和ΔMrPks中,经抗性筛选和Southern杂交验证后,成功获得7株ΔMrNrps,5株ΔMrAbct,4株ΔMrMfst,4株M7::PtrpC-MrMfst,21株ΔMrMfst::PtrpC-MrMfst和13株 ΔMrNrps+ΔMrPks。3.突变菌株的表型分析对上述突变菌株的形态特征和SMs等的表型变化进行了分析,结果表明,与M7相比,突变菌株的菌丝、分生孢子和闭囊壳都没有显著变化。在SMs方面,ΔMrNrps,ΔMrNrps+ΔMrPks和ΔMrMfst均不产生PG及其中间产物异青霉素N（IsopenicillinN,IPN）,但ΔMrAbct可产生PG和IPN,不过产量比红曲菌M7的少,而ΔMrMfst::PtrpC-MrMfst可恢复PG和IPN的产生,M7::PtrpC-MrMfst可产生比M7更多的PG和IPN。这些结果表明,当MrNrps、MrPks和MrMfst被敲除后,可完全阻断PG和IPN的产生,而MrAbct被敲除后仅能部分阻断PG和IPN的产生。4.突变菌株对合成PG合成前体的敏感性研究研究了合成PG的3种前体PAA、L-Cys和D-Val对M7及其突变菌株产PG的影响,结果表明,当它们的浓度为2 mM,L-Cys可使所有突变菌株与M7的菌落减小,但D-Val和PAA对菌落大小的无明显影响。分析了 3种前体对PG产生的影响,结果表明,在ΔMrNrps、ΔMrMfst和ΔMrNrps+ΔMrPks中仍没有检测到PG,但是3种前体均可提高ΔMrMfst::PtrpC-MrMfst和M7::PtrpC-MrMfst中PG的产量,其中D-Val提高最明显。同时,3种前体均可降低ΔMrAbct的PG产生,且PAA降低最明显。这些结果再次证明,当MrNrps和MrMfst被敲除后,可完全阻断PG的产生,同时也表明MrAbct对PAA的敏感性高于L-Cys和D-Val。5.ΔMrAbct对弱有机酸和PAA的敏感性研究以qPCR分析了红曲菌M7中所有ABC转运蛋白基因在10 mM的PAA下的转录水平,发现MrAbct转录水平最高。进一步分析了 ΔMrAbct对山梨酸、己二酸和乙酸单独或与PAA共同存在时的敏感性,结果显示,这些有机酸都不影响MrAbct转录水平,因此推测该基因可能专门负责PAA的转运。