论文部分内容阅读
目的：本实验通过使用带有DDK标签的Beclin1表达载体转染细胞,观察HLA在人类卵巢癌细胞SKOV3中的表达情况，探讨自噬基因Beclin1对HLA基因蛋白表达的影响和与卵巢癌临床病理学的关系,并初步探讨Beclin1在过表达的情况下对人卵巢癌细胞SKOV3免疫学方面的影响，从自噬对免疫影响这一方面进一步阐明Beclin1表达在卵巢癌发生及进展中所起的作用，本研究结果可为卵巢癌的病因研究及临床免疫治疗提供一定的理论基础和可行的思路。方法：1利用细胞基因转染技术、Real Time-PCR、RT-PCR及Western blot实验方法研究外源性Beclin1过表达后对卵巢癌细胞SKOV3的HLA抗原表达情况的影响。2通过MTT法分析外源性Beclin1过表达后对卵巢癌细胞SKOV3增殖活性的影响情况。3在荧光显微镜下观察转染后卵巢癌细胞的自噬现象。结果：1将pCMV6-Entry-Beclin1和pCMV6-Entry表达载体转染到SKOV3细胞中，通过RT-PCR结果显示：与空白对照组相比较，转染pCMV6-Entry-Beclin1载体后，Beclin1基因表达明显提高，提示表达载体可用于后续的实验。2为了探讨Beclin1和HLA在卵巢癌中的生物学行为，本实验采用瞬时转染技术，将pCMV6-Entry-Beclin1和pCMV6-Entry转染SKOV3细胞中，再从mRNA和蛋白表达及细胞增殖等方面观察HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ的表达情况的变化。2.1pCMV6-Entry-Beclin1转染SKOV3细胞(SKOV3-Beclin1group)后，Beclin1和HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ在mRNA及蛋白表达水平上均高于空载体组(SKOV3-Entry group)及未转染组(SKOV3group)。2.2MTT结果显示，与空载体组和空白对照组相比，SKOV3-Beclin1组细胞生长明显受到抑制。在转染后24h、48h、72h和96h后，SKOV3-Beclin1组细胞的生长抑制率分别为42.60%，37.87%，24.35%,4.81%.综上结果表明，pCMV6-Entry-Beclin1转染后可明显抑制SKOV3细胞的增殖活性。2.3RT-PCR检测各组细胞中Beclin1基因及HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ等位基因表达结果显示，空白组、转染组和空转染组各组细胞中Beclin1基因的表达量分别为0.6609±0.0457，1.5973±0.1491，0.6661±0.0316。HLA-Ⅰ等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C在以上各组细胞表达情况分别为0.8223±0.0704，1.6227±0.2427，0.7835±0.0842；0.6785±0.15271，0.4491±0.2191，0.5992±0.1705；0.6626±0.0803，1.2284±0.1742，0.6820±0.0591。HLA-Ⅱ等位基因HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR在以上各组细胞的表达情况分别为0.5043±0.1030，1.6283±0.1698，0.4844±0.1731；0.2551±0.1128，1.1219±0.2517,0.3212±0.1598；0.5670±0.0642，1.5132±0.2356，0.5014±0.2524。各组细胞的试验数据采用单因素方差分析SNK两两比较和非参数检验均有统计学意义（P＜0.01）。2.4Real Time RT-PCR检测各组细胞中Beclin1基因及HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ等位基因表达结果显示，空白组，转染组，空转染组各组细胞中Beclin1基因表达分别为1.3861±0.0066，9.2922±0.2715，1.8350±0.1015；HLA-Ⅰ等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C在以上各组细胞表达情况分别为5.9848±0.0783，14.5475±0.0545，6.0894±0.0140；1.7167±0.0580，2.7984±0.1515，1.7973±0.0192；3.8161±0.0449，12.1393±0.0463，4.6966±0.1527。HLA-Ⅱ等位基因HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR在以上各组细胞中表达的情况分别为6.8787±0.1833，16.7675±0.4850，7.6501±0.4856；2.9097±0.2281，25.5259±0.7104，3.8230±0.1273；6.1550±0.0511，19.1355±0.6053，6.3781±0.1222。各组细胞的试验数据采用单因素方差分析SNK两两比较和非参数检验均有统计学意义（P＜0.01）。2.5Western blot法检测空白组、转染组、空转染组各组细胞中Beclin1及HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ蛋白抗体表达结果显示，在以上各组细胞中Beclin1蛋白的表达量分别为5.6656±0.8535，11.6792±2.8931，5.1258±0.6148。HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ蛋白在以上各组细胞表达的情况分别为0.2131±0.0421，0.4208±0.0989，0.2208±0.0564；0.2143±0.0544，0.3503±0.0778,0.2143±0.0543。各组细胞试验数据采用单因素方差分析SNK两两比较均有统计学意义（P＜0.01）。2.6荧光显微镜观察到转染Beclin1组中MDC标记的自噬荧光信号强度最高，胞浆内出现了明显的绿色荧光信号。结论：1自噬基因Beclin1过表达可以抑制SKOV3细胞的增殖，自噬基因Beclin1对卵巢癌的基因治疗可能具有一定的可行性。2HLA的表达下调可能增加了卵巢癌细胞的免疫逃避，而自噬可能会促进机体对肿瘤细胞的免疫反应，通过自噬提高机体免疫可成为免疫疗法的一种新的思路。