LncRNA 8244-ssc-miR-320-CCR7在SVA感染PK-15细胞过程中对IFN-β的调控机制研究

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猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是一种小核糖核苷酸病毒,最初被称为塞内加谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)。SVA感染的主要症状是猪的蹄、嘴和鼻子出现水疱,并且可能会伴有跛足,仔猪表现为急性死亡。截至目前,巴西、美国、加拿大、泰国和中国等多个国家已经相继报道SVA阳性病例。但是,对SVA免疫相关的知识所知甚少。本研究通过高通测序得到SVA感染PK-15细胞后差异表达的lnc RNA,确定以lnc RNA 8244作为研究目标,探究其对免疫调节机制有何影响。具体研究结果如下:(1)在SVA感染后24 h,共诱导1043个lnc RNA差异表达,其中已知的lnc RNA420个,未知的lnc RNA 623个。GO富集和KEGG通路分析显示,lnc RNA靶基因富集于p53信号通路、RIG-I样受体信号通路、MAPK信号通路和Ig A生成的肠道免疫通路等,初步表明lnc RNA参与了SVA对PK-15细胞的感染过程。(2)实验使用0.3 MOI、1 MOI、1.5 MOI、3 MOI和4.5 MOI的SVA病毒液对PK-15细胞进行接毒,与未接毒的对照组细胞相比,0.3 MOI的接毒剂量就能使lnc RNA8244的表达量显著下调(P<0.01),1.5 MOI、3 MOI和4.5 MOI的接毒剂量能够使lnc RNA8244的表达量极显著下调(P<0.01)。实验使用SVA的3CD、3C、VP4、L、VP1、VP2、3AB、2C、VP3、2AB、3ABC、2B、3BC、2A、3D蛋白质粒在PK-15细胞进行转染,结果显示十五个蛋白质粒转染后都能下调lnc RNA8244的表达,其中2C能够极显著下调lnc RNA 8244的表达(P<0.01)。(3)转染lncRAN 8244 plasmid组的IFN-β表达在m RNA水平以及蛋白水平的表达都极显著高于对照组的表达水平。相对于转染si-RNA control组的IFN-β表达量,si-lnc RNA 8244组的IFN-β在m RNA水平以及蛋白水平的表达都极显著被抑制(P<0.01)。(4)相比于对照组,转染lnc RNA 8244 plasmid后TLR信号通路的关键分子表达量显著上调,其中TLR3分子的表达量极显著上调(P<0.01)。对TLR3所涉及的信号通路的关键分子表达量进行检测,lnc RNA 8244 plasmid转染组相比于对照组,TLR3相关通路分子TRIF在接毒后24 h、48 h、72 h表达量极显著上调(P<0.01)。TBK 1在接毒后72 h表达量极显著上调(P<0.01),TRAF3和IRF3表达量与对照组相比无显著差异(P≥0.05)。lnc RNA 8244 plasmid转染组相比于对照组极显著促进了TLR3的表达(P<0.01);si-lnc RNA 8244转染组相比于对照组显著抑制了TLR3的表达(P<0.05)。(5)本研究使用在线靶基因预测软件Reg RNA 2.0以及miranda算法双重预测了与lnc RNA 8244有靶向关系的miRNA,通过对预测的得分和互补配对匹配自由能进行筛选后发现ssc-miR-320是lnc RNA 8244的靶向miRNA,并且预测得到ssc-miR-320的靶基因为CCR7。通过荧光定量以及双荧光素酶实验确定了lnc RNA 8244、ssc-miR-320以及CCR7之间的靶向关系。(6)与对照组相比ssc-miR-320 mimics转染组IFN-β的表达量显著下调(P<0.05),ssc-miR-320 inhibitor转染组与对照组相比IFN-β的表达量显著上调(P<0.05)。(7)ssc-miR-320 mimics转染组相比于对照组极显著抑制了TLR3的表达(P<0.05);ssc-miR-320 inhibitor转染组相比于对照组极显著促进了TLR3的表达(P<0.01)。plasmid 8244与ssc-miR-320 mimics共转染实验组与对照组相比TLR3表达差异不显著(P≥0.05),si-lnc RNA 8244与ssc-miR-320 inhibitor共转染组与对照组相比TLR3表达差异不显著(P≥0.05)。(8)与对照组相比plasmid CCR7转染组IFN-β的表达量极显著上调(P<0.01),si-CCR7转染组与对照组相比IFN-β的表达量显著下调(P<0.05)。同时发现共转染plasmid 8244与si-CCR7组与对照组相比IFN-β的表达无显著差异,共转染si-lnc RNA8244与plasmid CCR7与对照组相比IFN-β表达水平无显著差异(P≥0.05)。(9)相比于对照组,plasmid CCR7转染后,TLR3相关通路的分子TRIF在接毒后24 h和48 h表达量显著上调(P<0.05)。TBK1在接毒后48 h表达量显著上调(P<0.05),IRF3和TRAF3的表达量与对照组相比无显著差异(P≥0.05)。共转染plasmid 8244与si-CCR7组以及共转染si-lnc RNA 8244与plasmid CCR7对照组相比TLR3表达均差异不显著(P≥0.05),Western Blot检测结果与荧光定量结果一致。本实验通过对lnc RNA 8244-ssc-miR-320-CCR7之间的内在联系以及其对IFN-β表达的影响进行探究,为lnc RNA调控SVA感染的分子机制打下基础。
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