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目的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种老年人常见的神经退行性疾病,主要以SNCA基因编码的突触核蛋白α-synuclein(α-syn)聚集形成路易小体(Lewy bodies,LBs)和黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元减少为主要特征。PD患者临床上主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌肉僵直等运动症状。在运动症状出现之前往往伴随非运动症状的出现,包括焦虑、抑郁、认知功能障碍、嗅觉功能障碍等。PD的发病不仅严重影响患者的生活,还给患者家庭带来沉重的负担。α-syn主要通过调节神经递质的释放参与突触连接的建立和突触传递。A53T突变是一种家族遗传性PD中常见的α-syn突变类型。A53T突变型α-syn比野生型α-syn更易发生聚集,并进一步形成纤维结构。α-syn的聚集可能会形成LBs,进一步造成突触损伤,甚至神经元的死亡。而且,α-syn的聚集若超出内质网非折叠蛋白反应(UPR),可能会引起内质网应激,启动依赖于CHOP信号的凋亡途径,导致神经元死亡。另外,炎症反应在PD发生中也发挥着重要作用。因此,本实验利用构建的AAV9-synapsin-human SNCA(A53T)-P2A-m Cherry病毒表达载体,通过脑立体定位注射于小鼠右侧黑质,使人源α-syn(A53T)在黑质中高表达,研究其对小鼠运动行为和相关非运动行为的影响,对黑质多巴胺能神经元的损伤及损伤机制,以及对纹状体和嗅球的影响。方法1.小鼠右侧黑质注射AAV9-synapsin-human SNCA(A53T)-P2A-mCherry病毒表达载体:将构建好的AAV9-synapsin-human SNCA(A53T)-P2A-m Cherry病毒表达载体,通过脑立体定位注射于2月龄的C57BL/6小鼠右侧黑质,对照组注射AAV9-synapsin-P2A-mCherry。2.AAV9介导的人源α-syn(A53T)表达稳定性评价:人源α-syn(A53T)病毒表达载体注射15天、3个月、7个月后,灌注、取脑、切片,免疫荧光检测小鼠右侧黑质TH(tyrosine hydroxylase)阳性神经元,免疫组化检测人源α-syn(A53T)的表达。通过观察右侧黑质mCherry、TH和人源α-syn(A53T)表达,评价病毒感染情况、病毒感染的细胞类型以及人源α-syn(A53T)在黑质的持续表达。3.行为学检测:人源α-syn(A53T)病毒表达载体注射7个月,通过开场实验评价小鼠自发活动;倒网格实验、圆柱筒实验和爬杆实验评价小鼠的运动功能;嗅闻偏好实验和食物埋藏实验评价小鼠的嗅觉功能;Morris水迷宫定位航行实验评价小鼠的空间认知功能;三箱实验评价小鼠的社交认知功能。4.AAV9介导的人源α-syn(A53T)在小鼠右侧黑质持续表达7个月,对同侧黑质DA能神经元的损伤及可能机制:人源α-syn(A53T)病毒表达载体右侧黑质注射7个月,取材,免疫组化检测小鼠右侧黑质TH表达和Iba1的表达;透射电镜观察小鼠右侧黑质包涵体的形成;Western Blot检测右侧中脑P62、Grp78和CHOP蛋白表达水平。6.AAV9介导的人源α-syn(A53T)在小鼠右侧黑质持续表达,对同侧嗅球僧帽细胞老化的影响:人源α-syn(A53T)病毒表达载体右侧黑质注射3个月、7个月,取材,免疫组化检测同侧嗅球人源α-syn(A53T)的表达;注射7个月,β-半乳糖苷酶染色检测同侧嗅球僧帽细胞的老化。5.AAV9介导的人源α-syn(A53T)在小鼠右侧黑质持续表达,对同侧纹状体突触的影响:人源α-syn(A53T)病毒表达载体右侧黑质注射3个月、7个月,取材,免疫组化检测同侧纹状体人源α-syn(A53T)的表达;注射7个月,透射电镜观察小鼠同侧纹状体突触结构。结果1.AAV9介导的人源α-syn(A53T)在小鼠右侧黑质表达的稳定性:右侧黑质注射15天,发现病毒表达载体可以感染右侧黑质DA能神经元;注射3个月、7个月,人源α-syn(A53T)呈现稳定持续的高表达。2.AAV9介导的人源α-syn(A53T)在小鼠右侧黑质持续表达7个月,导致小鼠自发活动减少,运动功能降低,嗅觉敏感性降低,空间认知功能降低,社交认知功能降低。3.AAV9介导的人源α-syn(A53T)在小鼠右侧黑质持续表达7个月,小鼠右侧黑质TH阳性神经元出现丢失;右侧黑质中出现类似包涵体样结构,P62蛋白表达水平升高;Grp78、CHOP蛋白表达升高;小胶质细胞活化明显,表现为胞体增大,突起缩短。4.AAV9介导的人源α-syn(A53T)在小鼠右侧黑质持续表达3个月、7个月,小鼠右侧纹状体投射纤维大量表达人源α-syn(A53T);并且人源α-syn(A53T)在小鼠右侧黑质持续表达7个月,小鼠右侧纹状体突触结构出现异常。5.AAV9介导的人源α-syn(A53T)在小鼠右侧黑质持续表达3个月、7个月,小鼠右侧嗅球大量表达人源α-syn(A53T);并且人源α-syn(A53T)在小鼠右侧黑质持续表达7个月,小鼠右侧嗅球中老化的僧帽细胞增多。结论1.人源α-syn(A53T)在黑质中持续高表达,造成小鼠运动功能降低,并伴随嗅觉敏感性下降、空间认知和社交认知功能降低的非运动症状。2.人源α-syn(A53T)在黑质中持续高表达,可以引起蛋白聚集,形成类似包涵体样结构;引起内质网应激和炎症反应。这些病理改变可能导致DA能神经元丢失。3.人源α-syn(A53T)在黑质中持续高表达,导致纹状体突触结构异常;加速嗅球中僧帽细胞老化。