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流行病学调查显示活性维生素D的缺乏与衰老和结肠癌的发生发展密切相关,炎性肠病是患结肠癌的高风险因素,但其具体作用机制尚不清楚。25-羟化维生素D 1α-羟化酶(1α(OH)ase,由Cyp27b1基因编码)参与了活性维生素D(1,25(OH)2D3)的合成。该基因的敲除可以获得活性维生素D缺乏的小鼠模型(Cyp27b1-/-),是研究活性维生素D作用的有效工具。我们对该小鼠模型研究发现,Cyp27b1-/-小鼠结肠出现了明显的炎症和细胞衰老表型。进一步分析发现活性维生素D缺乏的小鼠结肠氧化应激水平增高,DNA损伤明显,同时衰老相关分泌因子表达明显增加。因此我们推测活性维生素D的缺乏可能通过加速细胞衰老,分泌相关炎症因子,促进结肠炎症的发生发展。具体研究过程如下:通过生化检测,高钙磷饮食(含2%钙、1.25%磷和20%乳糖)可以将10月龄雄性Cyp27b1-/-(KO)小鼠的血清钙磷水平纠正至野生型小鼠水平,而血清中1,25(OH)2D3的水平仍远远低于野生型小鼠水平,从而排除了血清钙磷水平在本研究中的影响。为了明确1,25(OH)2D3缺乏是否引起结肠组织炎症,我们称量了不同月龄小鼠体重,统计了 10月龄小鼠结肠长度及结肠长度与体重的比值,并利用HE染色、CD3和F4/80免疫组织化学染色,分析比较了高钙高磷饮食KO和野生型小鼠结肠组织表型的差异。结果显示:与野生型小鼠相比,10月龄Cyp27b1-/-小鼠结肠组织呈现明显的炎症表型,包括体重减轻、结肠长度的缩短、结肠长度与体重的比值降低、CD3和F4/80阳性细胞百分率明显增加及结肠黏膜缺损、腺体破坏或消失,杯状细胞减少等。这些结果说明1,25(OH)2D3缺乏能够引起小鼠结肠组织炎症。为了明确1,25(OH)2D3缺乏引起的结肠组织炎症是否与结肠组织衰老有关,我们利用Western blot、免疫组织化学检测结肠组织中p16的表达水平,并利用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)组织化学染色比较分析了结肠组织SA-β-Gal活性改变;结果显示:与野生型小鼠相比,在Cyp27b1-/-小鼠结肠组织中p16的蛋白表达水平及阳性面积百分率都明显增高;β-半乳糖苷酶组织化学染色显示Cyp27b1-/-小鼠结肠组织SA-β-Gal阳性面积百分率明显增加。这些结果说明1,25(OH)2D3缺乏能够加速结肠组织的衰老。为了明确1,25(OH)2D3缺乏引起的结肠组织炎症是否与结肠组织增殖及凋亡有关,我们利用Western blot,免疫组织化学检测结肠组织中细胞周期、增殖相关蛋白CyclinE,CyclinD,PCNA等指标的表达水平并利用TUNEL检测其凋亡水平;结果显示:与野生型小鼠相比在Cyp27b1-/-小鼠结肠组织中CyclinE,CyclinD,PCNA的蛋白表达水平明显降低且PCNA阳性细胞百分率明显降低,而凋亡阳性细胞百分率没有明显变化。这些结果说明1,25(OH)2D3缺乏可抑制结肠组织细胞的增殖。为了明确1,25(OH)2D3缺乏引起的结肠组织炎症是否与结肠组织细胞衰老相关分泌表型(SASP)改变所产生的炎症因子有关,我们利用免疫组织化学及Real time RT-PCR技术检测了野生型和Cyp27b1-/--小鼠结肠组织中SASP主要因子(包括IL-1α,IL-1β,1L-6,IL-8,HGF,MMP-3)的蛋白及mRNA表达水平以及调控SASP的关键转录因子NF-κB的蛋白表达水平的变化。结果显示:与野生型小鼠相比,在 Cyp27b1-/-小鼠结肠组织 SASP 因子 IL-1α,IL-1β,IL-6,IL-8,HGF,MMP-3 阳性面积百分率和mRNA表达水平均明显增加,调控SASP的重要转录因子NF-κB的蛋白表达水平也明显增加。这些结果说明1,25(OH)2D3缺乏引起的结肠组织炎症的发生与1,25(OH)2D3缺乏引起的SASP因子表达上调有关。为了明确1,25(OH)2D3缺乏引起的结肠组织细胞衰老是否与DNA损伤增加有关,我们利用Western blot、免疫组织化学检测了结肠组织中DDR通路分子(包括γ-H2AX,8-OHdG)的表达水平。结果显示:与野生型小鼠相比,在Cyp27b1-/-小鼠结肠组织中γ-H2AX,8-OHdG阳性细胞百分率明显增加且γ-H2AX的蛋白表达水平也明显增加;这些结果说明1,25(OH)2D3缺乏引起的结肠组织细胞衰老与1,25(OH)2D3缺乏引起的DNA损伤增加有关。为了明确1,25(OH)2D3缺乏引起的结肠组织细胞衰老是否与1,25(OH)2D3缺乏引起的氧化应激水平增加有关,我们利用流式细胞术、生化检测、Real time RT-PCR比较分了结肠组织中氧化应激相关指标和抗氧化酶相关分子的变化。结果显示:与野生型小鼠相比,在Cyp27b1-/-鼠结肠组织ROS水平、过氧化氢(H202)水平明显升高,而总超氧化物歧化酶(T-SOD)水平明显下降;抗氧化酶相关指标的基因表达水平和蛋白表达水平均明显降低。这些结果说明1,25(OH)2D3缺乏引起的结肠组织细胞衰老与1,25(OH)2D3缺乏引起的氧化应激增加有关。本研究结果表明1,25(OH)2D3缺乏能够引起小鼠结肠组织内氧化应激和DNA损伤增加,加速结肠组织衰老,继而衰老相关分泌因子上调,促进结肠组织炎症的发生发展。本研究结果不仅阐述了 1,25(OH)2D3缺乏导致结肠组织炎症发生发展的机制,而且为活性维生素D用于结肠炎症的防治提供了理论和实验依据。