我国是棉花生产大国，据国家统计局《2015年国民经济和社会发展统计公报》显示，2015年中国棉籽饼（粕）产出约占世界总产量的23%，足以解决上亿人口的蛋白质需求。但由于棉酚的毒性，棉副产品主要用作肥料和燃料，造成了巨大的资源浪费。多年来，相关研究主要集中在探索棉籽饼（粕）的脱毒方法，目前各方案都存在成本高、对饲料品质影响大等局限性，大大阻碍了棉副产品的高附加值利用。因此，本项目转变思路，深入研究棉酚的毒性机理，为从根本上解决棉酚毒性提供理论基础。　　之前的研究报道，精原干细胞对棉酚毒性最为敏感，但其毒性机理尚未明确，因此本研究聚焦于棉酚损伤山羊精原细胞的分子机理。首先用细胞毒实验和早凋亡检测等方法精确评估棉酚毒性量效关系，在此基础上通过多种探针研究棉酚诱导的线粒体损伤和活性氧消除障碍，在ROS消除剂硫辛酸和过氧化氢预处理下检测棉酚对线粒体功能的影响，得出棉酚诱导的ROS水平升高是产生线粒体损伤的关键原因。利用棉酚去醛基衍生物阿朴棉籽酚酮（ApoG2）设置对照，研究棉酚毒性的化学结构基础，发现其分子内醛基对棉酚精原干细胞毒性有着重要影响。最后应用多种抑制剂和激活剂研究棉酚损伤精原干细胞的SIRT1-P53-PUMA信号通路，主要关注棉酚作用下关键信号分子的互作关系，并正反向验证，找出影响棉酚毒性的潜在靶蛋白，为将来预防和治疗棉酚中毒，以及降低棉酚慢性毒性损伤风险提供重要理论基础。　　本研究主要方法和结果如下：　　1.棉酚致精原干细胞活性氧簇(ROS)消除障碍，损伤线粒体产生细胞凋亡。　　首先，通过精原干细胞早期凋亡和周期检测发现，棉酚诱导的精原干细胞丢失来源于细胞凋亡。进一步检测凋亡下游信号后发现棉酚处理引起Caspase-9激活，这提示凋亡来自于线粒体途径。进一步的JC-1探针染色和ATP胞内浓度测定发现棉酚处理导致了线粒体膜电位下降和ATP产生减少，应用DCF和DHE等探针相对定量发现棉酚诱导了活性氧消除障碍。利用硫辛酸和外源过氧化氢操纵精原干细胞内ROS水平，正反向验证，确定是由棉酚诱导的ROS水平升高引起了线粒体损伤。因此棉酚诱导的ROS消除障碍是其毒性产生的关键环节。　　2.棉酚醛基是导致精原干细胞ROS消除障碍和线粒体损伤性细胞凋亡的重要原因。　　在初步确认ROS消除障碍介导了棉酚精原干细胞损伤的基础上，广泛检索文献并深入分析棉酚分子结构，发现棉酚分子内醛基可能烷化加成细胞内谷胱甘肽（glutathione，GSH），从而破坏了细胞内以GSH为基础的ROS消除体系，为具体研究醛基对棉酚精原干细胞毒性的贡献，我们利用棉酚去醛基衍生物ApoG2作为对照进行实验研究，发现相比于含有醛基的棉酚，ApoG2不会导致GSH缓冲系统的反应平衡往氧化方向偏移。相比于棉酚处理，ApoG2处理不引起ROS水平上升、线粒体膜电压下降和胞内ATP浓度下降，也未引起精原干细胞凋亡等典型毒性损伤，因此发现棉酚醛基是导致ROS消除障碍和凋亡的重要化学结构基础。　　3.棉酚通过SIRT1-P53-PUMA信号通路诱导精原干细胞凋亡。　　在棉酚诱导精原干细胞凋亡的下游信号通路研究上，利用过氧化氢和硫辛酸操控精原干细胞ROS水平，发现在棉酚处理中，高ROS水平导致了细胞内NAD+/NADH比率上升，抑制下游1型去乙酰化酶（Sirtuin type1，SIRT1）活性。利用Western blotting证明棉酚通过抑制P53去乙酰化水平，提高了P53浓度，最终提高了P53上调凋亡调制物（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）的表达水平。在棉酚诱导凋亡的直接效应方面，利用抑制剂正反向验证棉酚诱导的早期凋亡，发现棉酚诱导精原干细胞损伤可能通过SIRT1-P53-PUMA信号通路起作用这一结论。　　总之，本研究发现了棉酚损伤精原干细胞的部分毒理机制，以期将来能从这些棉酚化学结构信息和关键信号蛋白互作入手，找出预防棉酚毒性的特效药或饲料添加剂，从根本上防治棉酚中毒病，以提高棉籽饼（粕）的饲料、食品等高附加值利用水平，服务于养殖过程中优质廉价蛋白质饲料缺乏这一关键科学问题。另外，本研究也为为棉酚衍生物的抗肿瘤和男性避孕药应用提供了一定参考。