尿路感染（urinary tract infection,UTI）是指细菌或真菌侵犯尿路粘膜或组织引起的尿路炎症,是机体最常见的感染性疾病之一。近年来随着临床上高效广谱抗菌药物的广泛应用,耐药细菌大量出现,导致UTI治疗的难度逐步攀升。大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）是引起UTI的最主要病原菌,发病率占总病例的80%以上。目前E.coli出现的主要耐药基因是超广谱β内酰胺酶类（extended-spectrum β-lactamases,ESBLs）,包括CXT-Ms、OXAs、AmpC以及碳青霉烯酶等,这导致诸多一线抗生素难以发挥作用,而抗生素的更新速度越来越难满足临床需求。针对此种情况,越来越多的研究者希望从中医药寻求防治UTI的新途径和有效药物,探寻细菌侵染宿主的过程,通过干预细菌-宿主反应过程来抑制细菌的感染。引起人类UTI的大肠杆菌被称为尿路致病性大肠杆菌（Uropathogenic Escherichia coli,UPEC）。UPEC在宿主体内经历的生理过程大致分为4步:细菌粘附于尿路上皮细胞、细菌入侵进入细胞内部、细菌于细胞内部增殖、细胞破碎释放细菌,其中细菌粘附尿道上皮细胞这一步骤是启动整个UTI生理过程的关键的环节。细菌表面的多种菌毛是UPEC粘附于尿路上皮的主要器官,介导这种粘附作用的菌毛主要有1型、P型、F1C型和S型菌毛,菌毛表面的纤维粘附素,如fimH、fimA、fimB、JimE、papG等与位于尿道细胞膜上的不同受体结合,实现对宿主的粘附。对于1型菌毛介导的粘附环节研究最为透彻,位于1型菌毛最上端的fimH与尿路上皮富含甘露糖基团的尿空癍蛋白Ia（UroplakinIa,UP Ia）稳定结合,实现粘附过程。粘附过程完成后可立刻激活宿主Toll样受体通路-4（Toll-like receptor 4,TLR4）,从而引发机体黏膜免疫反应,阻止细菌进一步入侵尿路上皮细胞。此外,位于宿主尿路组织膜蛋白上的caveolin-1和integrin β1通过调控多种细胞黏附分子和外基质间的信号传导,也参与细菌粘附和侵袭过程。鞭毛是UPEC的运动器官,它既可以作为粘附的动力装置,又能分泌毒力因子,在细菌生物膜形成和快速定植中起重要作用。鞭毛运动的瞬时表达对于泌尿道中UPEC的最初定殖很重要。细菌鞭毛是由fliC编码的鞭毛蛋白聚合亚基组成的长螺旋表面附件,电flhC和flfD基因组成的flhDC操纵子是调控鞭毛生成的主调节子,敲除flhDC基因后,细菌运动性下降,在生物材料表面形成生物膜的能力下降。此外,细菌与鞭毛运动相关基因的表达还可以调控自身蜂群运动。蜂群运动是细菌运动的鞭毛依赖性形式,通过调节自身基因表达控制许多生理活动,如毒力因子产生、运动和生物膜形成,尤其重要的是促进细菌在粘性底物上的迁移。细菌通过这种运动方式实现快速迁移,可以在营养丰富的环境中定殖。石竹清是中药王不留行水提醇沉部位,本课题组早期研究发现石竹清可以明显降低UTI志愿者尿液中的白细胞,迅速缓解尿路刺激症状,对于耐药菌感染者亦有同样的治疗效果。本研究在前期工作的基础上,建立多种经典的体内外尿路感染相关模型,对石竹清治疗急性尿路感染的药效作用进行系统性评价。我们在研究中还发现,石竹清在体外实验中未表现出对UPEC的直接杀灭作用,但可以大幅降低细菌在膀胱上皮细胞粘附及入侵的数量,这提示石竹清在UTI中的治疗效果可能不依赖于其对UPEC的直接杀伤作用。我们前期研究工作证实石竹清抗尿路感染的活性成分为多糖类,结合fimH蛋白多糖类结构抑制剂的研究动态,我们推测石竹清治疗UTI的作用机制可能在于抑制细菌粘附环节,本研究将从这一环节入手,从宿主和细菌两方面对石竹清起效的作用机制进行深入探究。本研究包括两部分:石竹清治疗急性尿路感染药效评价;石竹清治疗急性尿路感染机制研究。第一部分:石竹清治疗急性尿路感染药效评价目的:运用经典的急性尿路感染相关细胞和动物模型,通过体内外预防和治疗性干预实验,系统评价石竹清对急性尿路感染的药效作用,为进一步机制研究奠定基础。方法:优化UPEC致尿路上皮细胞体外感染模型、UPEC（CFT073株）感染致小鼠尿路感染模型、UPEC（CFT073株）感染致大鼠尿路感染模型和环磷酰胺致小鼠膀胱炎疼痛模型4种体内及体外UTI相关模型。根据国家有关中药新药临床前药效评价要求以及石竹清临床适应症设计了 5个体内及体外药效学实验,系统评价其对急性尿路感染的药效作用。体外实验中以细菌致细胞病变情况,细菌粘附与定植于细胞内数量,生物膜形成情况为主要观察指标,评价石竹清对尿路上皮细胞的抗粘附作用以及对细菌生物膜的影响。大、小鼠尿路感染体内实验中以尿液中红、白细胞数,尿液、膀胱、肾脏中菌落数,脏器指数,膀胱、肾脏组织病理学改变为观察指标,评价石竹清治疗急性尿路感染的总体药效。小鼠膀胱炎疼痛模型中以疼痛样行为、内脏敏感性以及疼痛相关酶和细胞因子的含量观察指标,评价石竹清对炎症引发的疼痛的药效作用。结果:5个药效实验分别阐述。1石竹清对UPEC致尿路上皮细胞体外感染模型的影响细菌感染尿路上皮细胞5637和A498后,细胞均出现了大量死亡,细胞上清液中的LDH释放明显增加;石竹清药物干预组（50μg/mL）两种尿路上皮细胞死亡情况有明显改善,细胞上清液中的LDH释放显著减少。将10株耐药或敏感型UPEC静置培养48 h后,检测各组细菌生物膜形成情况,发现石竹清药物干预组（50μg/mL）生物膜形成量显著减少,提示石竹清能明显减少UPEC生物膜的形成量。2石竹清对UPEC致小鼠尿路感染模型的预防作用石竹清可以明显抑制小鼠尿液、膀胱、肾脏中细菌数,小鼠脏器指数较模型对照组也有不同程度的降低。病理形态学观察后发现,预防性给予石竹清后小鼠膀胱组织嗜中性粒细胞浸润、黏膜上皮细胞脱落、空泡变性,有不同程度改善或减轻;肾脏肾盂粘膜及粘膜下层水肿、炎性细胞浸润有明显改善。3石竹清对UPEC致小鼠尿路感染模型的治疗作用石竹清可以明显抑制小鼠尿液、膀胱、肾脏中细菌数,降低膀胱、肾组织脏器指数。病理形态学观察后发现,治疗性给药石竹清后小鼠膀胱组织肿胀、炎症渗出,移行上皮透明样变等病变有不同程度减轻或改善;肾脏肾小球及曲管内团块状炎症、曲管囊性变等与模型组相比有不同程度减轻,间质新生组织细胞增生,肾小球多见,曲管囊性、炎性病变有明显改善,并有大量新生曲管再生。4石竹清对UPEC致大鼠尿路感染模型的影响石竹清可以明显抑制大鼠尿液、膀胱、肾脏中细菌数,降低膀胱、肾组织脏器指数。病理形态学观察后发现,石竹清三个不同剂量组大鼠膀胱移行上皮改变,炎症水肿、瘀血等病变有不同程度减轻或改善;肾脏肾小球增大、瘀血,曲管肿胀、集合管间质炎症等病变明显减轻。5石竹清对环磷酰胺致小鼠膀胱炎疼痛模型的影响石竹清能够快速缓解环磷酰胺诱发的炎性疼痛。给药后各时间段膀胱疼痛样行为明显减轻,内脏痛觉敏感性降低,并且两项指标均表现出良好的量效关系。膀胱组织中疼痛相关酶和细胞因子表达量降低。膀胱组织肉眼观察发现,石竹清对环磷酰胺诱导的膀胱组织水肿,出血等病变有改善作用。结论:石竹清能抑制UPEC感染所致的细胞死亡,减少细菌生物膜形成量。石竹清能够降低尿路感染大、小鼠尿液中的白、红细胞数,减少尿液、肾、膀胱内细菌量,改善膀胱及肾组织病理损伤。石竹清对环磷酰胺诱导的膀胱损伤（水肿、出血）有改善作用,能够快速缓解炎性引发的疼痛,降低疼痛相关细胞因子释放,提示该药对炎症引发的疼痛有很好的药效作用。以上结论提示,石竹清对急性尿路感染有明显的防治作用。第二部分:石竹清治疗急性尿路感染机制研究目的:从细菌-宿主反应过程方面探讨石竹清对细菌粘附、运动以及炎症反应的影响,探索其治疗尿路感染的作用机制。方法:细菌粘附测定:UPEC感染膀胱上皮细胞（5637）2 h后,用PBS冲洗细胞以除去未粘附细菌,裂解细胞,将裂解物连续稀释后涂布在麦康凯琼脂培养皿上,孵育24 h后计算细菌CFU,进行细胞粘附细菌的定量。通过细胞粘附的细菌数量相对于来自相同实验的细菌总数计算粘附率。细菌侵袭测定:UPEC感染膀胱上皮细胞（5637）2 h后,用PBS冲洗细胞,加庆大霉素（100 μg/mL）处理1h以杀死细胞外细菌,再次用PBS冲洗后裂解细胞,将裂解物连续稀释后涂布在麦康凯琼脂培养皿上,孵育24 h后计算细菌数菌落数,进行细胞内细菌的定量。通过细胞内细菌的数量相对于来自相同实验的细菌总数计算侵袭率。细菌运动实验:使用软琼脂平板评估细菌运动性,将UPEC CFT073菌株（取琼脂生长的一个细菌菌落）在LB培养液中于37℃静置培养24 h,紫外分光光度计将细菌浓度调至OD=0.6,加入石竹清（50 μg/mL）,模型对照组不加药物,用无菌接种针将菌药混合物刺入软琼脂平板的中间,将平板置37℃恒温箱中培养17h。通过测量运动半径来确定细菌运动能力。利用Western blot法以及免疫荧光法检测小鼠膀胱组织中粘附相关蛋白或基因的表达量。采用RT-PCR法检测细菌菌毛、鞭毛、膀胱组织Toll样受体以及NF-κB基因的表达情况。利用CBA炎症因子测试盒检测膀胱组织和血清中炎症介质的含量。结果:从5个方面分别阐述。1石竹清对UPEC粘附和侵袭的影响UPEC CFT073可以快速粘附并侵入尿路膀胱上皮细胞,感染细胞2h后,该株细菌粘附率达到35%,侵袭率达21.7%。石竹清干预后,膀胱上皮细胞5637的粘附率降低至4.5%,入侵的细菌降低至细菌总量的1.6%。2石竹清对UPEC感染宿主的影响UPEC CFT073菌株感染C3H小鼠6 h后,UP Ia和UP Ib在膀胱组织粘膜下层、浆膜层、肌肉层高表达;UP Ⅲ在膀胱组织粘膜上层高表达。在给予石竹清（800 mg/kg、400 mg/kg）治疗后,Western Blot实验结果显示膀胱组织中UP Ia、UP Ⅲ表达均被明显的抑制,UP Ib表达也有降低趋势。膀胱组织中caveolin-1、integrin β1表达均被明显抑制。石竹清（50 μg/mL）干预组细胞中TLR2、TLR4、MyD88表达有明显的下降趋势。3石竹清对UPEC菌毛介导的粘附因子mIRNA的影响UPEC感染膀胱上皮细胞后,位于细菌菌毛远端的纤维粘附素fimA、fimB、fimE、fimH、csgA以及papG表达均明显上升。石竹清（50 μg/mL）干预后,上述6种菌毛粘附素mRNA表达均明显下降。4石竹清对UPEC鞭毛介导的运动的影响细菌接种到软琼脂平板后,快速在半固体琼脂溶液中繁殖、扩散,石竹清干预组细菌表现较低的运动性。检测UPEC鞭毛控制基因fliC、flhC以及flhD mRNA表达后发现石竹清（50μg/mL）可以显著抑制其表达。5石竹清对UTI小鼠NLRP3炎性小体及炎症介质的影响预防性给予石竹清后小鼠膀胱中炎症因子含量有不同程度降低。细菌感染小鼠6 h后,石竹清高剂量组（800 mg/kg）MCP-1、IL-6含量显著降低;石竹清低剂量组（200 mg/kg）TNF、MCP-1、IL-6含量显著降低。细菌感染小鼠24 h后,石竹清高剂量组IL-6含量显著降低。UPEC感染小鼠后病变主要是尿路上皮细胞脱落和炎性细胞的浸润,石竹清药物组以中性粒细胞为主的炎性细胞数量大量减少,HE染色结果与膀胱内炎性介质表达趋势一致。治疗性给予石竹清后小鼠血清中炎性因子释放量明显减少,其中高剂量组TNF、IFN-γ、MCP-1、IL-6、IL-10 含量,中剂量组 MCP-1、IL-6 含量,低剂量组 IL-12p70、MCP-1、IL-6、IL-10含量有明显降低趋势。小鼠膀胱组织中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis associated speck-like protein containing a CARD domain,ASC）、caspase-1 mRNA呈现高表达趋势。在给予石竹清治疗后膀胱组织中NLRP3、ASC以及caspase-1的基因表达量明显降低。结论:石竹清可以通过调控宿主尿路上皮膜蛋白的表达,抑制细菌Ⅰ型菌毛尖端粘附素的表达,减少细菌鞭毛介导的运动相关基因表达,破坏细菌蜂群运动及生物膜形成,进而影响UPEC在宿主体内的粘附与定植。此外,石竹清还可以减轻细胞破坏和炎症反应。综上所述,石竹清具有明显的防治UTI作用,通过干预细菌-宿主反应过程中粘附相关蛋白或基因表达,抑制细菌鞭毛介导的运动,阻止细菌内化到尿路黏膜层细胞内,可以调控Toll样受体和NLRP3炎性小体通路抑制细菌诱导的细胞破坏和炎症反应。本研究从UPEC两个非常重要的细胞器菌毛和鞭毛入手,发现了石竹清有效对抗UPEC所致UTI的重要作用靶点。这将对中药防治感染性疾病的相关研究提供思路上参考。创新点:1、首次对石竹清（王不留行水提醇沉部位）防治尿路感染进行研究,国内外未查到类似的相关报道。2、研究思路上另辟蹊径。大多数抗菌药物研究都集中在针对杀菌/抑菌环节,本研究另辟蹊径,以细菌毒力因子菌毛和鞭毛为研究对象,针对细菌与宿主反应过程中的粘附及定殖两个环节展开探索,寻找能有效对抗UPEC所致尿路感染药物的作用靶点。3、多角度研究。在受体分子表达和基因水平上,深入探讨了石竹清对UPEC的干预作用机制是通过调控细菌菌毛尖端粘附素及其受体,细菌鞭毛运动关键基因的表达,从而影响细菌粘附能力以及运动功能,发挥抑制细菌感染的作用。这一研究将对中药治疗UTI的药效机制研究提供借鉴和参考。