巨噬细胞是一种遍布全身的重要的免疫细胞,具有吞噬呈递抗原,清除体内病原体及细胞碎片等功能。巨噬细胞参与固有免疫和获得性免疫,在两种免疫反应中都发挥着不可或缺的作用。除了抵御病原体感染外,巨噬细胞参与器官稳态,组织发育和修复、慢性炎症、纤维化和癌症等各种病理生理过程。巨噬细胞具有高度异质性和可塑性。巨噬细胞所处的环境复杂多变,其表型可以被所处微环境重新塑造,在所处环境发生变化时自身表型也相应的发生变化。巨噬细胞被环境中的信号刺激做出特定的表型和功能变化的过程被称为极化。极化是一个可逆的过程,因此巨噬细胞群体处于动态变化中。巨噬细胞极化并不是严格的两个极端,许多与定义极化有关的基因也并非是有或无的状态。在机体中,极化相关基因的表达是由弱到强或由强到弱的连续性变化,二分为M1型和M2型巨噬细胞是对极化这复杂过程的简化描述。经典激活的巨噬细胞即M1型巨噬细胞出现在以Toll样受体(TLR)和干扰素信号转导为主的炎性环境中,参与机体抵御细菌和细胞内病原体的免疫应答,通常分泌多种促炎细胞因子,如IL-1β、IL-12和TNF-α等。替代性激活的巨噬细胞即M2型巨噬细胞通常被蠕虫感染、哮喘和过敏等以Th2反应为主导的环境所诱导,产生并分泌IL-10和TGFβ等细胞因子,参与寄生虫的清除和抑制炎症反应。哺乳动物细胞中的CMPK2是定位于线粒体膜上的一磷酸激酶,以ATP为磷酸基供体,磷酸化CMP、UMP、d CMP、d UMP以及dd C、d Fd C、ara C、BVDU等嘧啶核苷类似物,参与线粒体DNA的补救合成途径。以往的研究显示CMPK2在生物体抵抗病毒感染的过程中发挥作用,CMPK2通过参与干扰素抗病毒反应,影响病毒基因的转录和翻译,进而调控抗病毒感染的先天性免疫应答。在最近的一项研究中发现,NLRP3炎症小体活化需要CMPK2依赖性的mt DNA合成。小鼠中的CMPK2最开始是从由LPS处理后的RAW264.7分离制备的c DNA文库筛选获得,被命名为Tyki。在LPS刺激后的巨噬细胞,被寄生虫感染后的组织和经TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IFN-α等炎症相关细胞因子刺激后的组织中,CMPK2表达显著上调。这些表型提示CMPK2参与巨噬细胞活化和炎症反应。CMPK2在骨髓来源的细胞中的表达水平最高,而在其他类型细胞中表达水平非常低。CMPK2组织特异性的表达使其可能成为潜在的特异性免疫治疗药物靶点。我们利用CMPK2基因缺陷小鼠制备了CMPK2缺失的原代巨噬细胞。另一方面,我们通过构建CMPK2表达质粒,通过G418药物筛选获得稳定过表达CMPK2的RAW264.7细胞。通过分别给予IFN-γ/LPS或IL4刺激,在体外构建巨噬细胞极化模型,通过实时荧光定量PCR检测此过程中CMPK2对巨噬细胞i NOS、Arg1等极化相关基因的m RNA表达水平的影响。结果发现,在原代巨噬细胞中,同对照组相比CMPK2缺失后,M2型相关基因表达升高同时M1型相关基因的表达被抑制。在RAW264.7细胞系中,CMPK2过表达导致M2型相关基因表达降低而M1型相关基因的表达增高。ELISA检测此过程中细胞因子的分泌水平,CMPK2缺失后,M1型巨噬细胞IL12、IL6和TNF-ɑ分泌水平降低,M2型巨噬细胞IL10分泌水平升高。流式细胞术检测巨噬细胞极化状态,CMPK2的缺失抑制M1型巨噬细胞表面MHCII分子降低,促进M2型巨噬细胞CD206分子表达升高。这些结果显示CMPK2的表达促进巨噬细胞M1型极化同时抑制巨噬细胞M2型极化。对于极化相关信号通路的变化,我们采用Western Blot检测相关蛋白的活化状态与表达。实验结果发现,在CMPK2缺失的巨噬细胞中,IFN-γ/LPS诱导的STAT1、p38、AKT的磷酸化水平降低,而在CMPK2过表达细胞中,IFN-γ/LPS诱导STAT1、p38、AKT的磷酸化程度升高。同时,CMPK2缺失使IL4诱导的GSK3的磷酸化水平增高,而CMPK2过表达使IL4诱导的GSK3的磷酸化水平降低。这些结果提示CMPK2通过调节STAT1、GSK3等分子的磷酸化,参与巨噬细胞的极化,促使巨噬细胞的极化向M1型偏移。肿瘤为异常生长的组织。肿瘤组成成分并非只有增生的肿瘤细胞,还有许多包括成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞等其他细胞成分。而肿瘤相关巨噬细胞(TAM)作为肿瘤浸润免疫细胞中的主要细胞类型,与肿瘤进程的各方面息息相关。在大多数肿瘤中,如乳腺癌、黑色素瘤和肺癌中,TAM表现出一系列M2样巨噬细胞表型,与不良预后有关。前期我们检索相关数据库,发现CMPK2在多种肿瘤中差异性表达。我们选取其中的黑色素瘤作为研究对象,发现CMPK2促进黑色素瘤中CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的浸润,与黑色素瘤的预后有关。结合生信检索和上述实验结果,我们预测CMPK2可能影响TAM极化偏向性进而影响黑色素瘤的生长。我们在CMPK2基因缺陷小鼠建立皮下注射B16F10荷瘤模型,监测瘤体体积。实验结果表明,CMPK2基因缺陷小鼠同对照组实验小鼠比较,肿瘤的体积更大,与我们前期预测相吻合。我们取荷瘤小鼠的肿瘤组织,使用流式细胞术标记小鼠肿瘤内免疫细胞的分型及检测巨噬细胞极化状态,结果表明CMPK2基因缺陷小鼠肿瘤组织中巨噬细胞同对照组相比M2极化标志物CD206表达水平更高,同时肿瘤浸润的T细胞中CD4与CD8比例都降低。简而言之,通过相关试验我们发现CMPK2可以通过调节STAT1和GSK3的磷酸化促进巨噬细胞M1型极化,通过调节肿瘤免疫微环境抑制黑色素瘤的生长。