LncRNA CASC9/miR-505/ERCC1通路影响胃癌生长、迁移及机制的研究

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背景:胃癌(gastric carcinoma)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤,在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位。但是胃癌发生、发展的机制并不清楚。近年来的研究表明,长非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)广泛参与胃癌的发生与发展,可作为多种癌症生物标志物,并具有成为癌症治疗靶点的潜能。研究表明lncRNACASC9在多种肿瘤中发挥重要功能。尽管如此,lncRNACASC9在胃癌中的功能及其分子机制仍有待进一步研究。目的:研究胃癌患者癌组织样本以及癌旁健康组织中CASC9/miR-505/ERCC1通路的表达情况并分析其相关性及临床意义;检测胃癌细胞中CASC9、miR-505、ERCC1的表达情况以及相互关系;检测CASC9的表达;验证CASC9对胃癌细胞活力、增殖以及迁移能力的研究;揭示CASC9在胃癌中发挥功能的分子机制;阐明CASC9/miR-505/ERCC1通路对胃癌细胞活力、增殖以及迁移能力的影响。方法:1、收集胃癌患者癌组织样本以及癌旁健康组织样本,液氮研磨组织样本,Trizol法抽提RNA并逆转录成cDNA,最后通过实时定量PCR的方法检测CASC9/miR-505/ERCC1通路的表达情况;收集胃癌患者癌组织样本以及癌旁健康组织样本,液氮研磨组织样本,通过RIPA裂解法抽提蛋白,用蛋白免疫印迹技术检测胃癌患者癌组织样本以及癌旁健康组织中ERCC1的表达情况,分析二者的相关性及临床意义。2、培养胃癌细胞株 SGC-7901、MKN-45、HGC-27、MGC-803 及 GES-1正常人胃粘膜上皮细胞株,Trizol法抽提RNA并逆转录成cDNA,最后通过实时定量PCR的方法检测CASC9/miR-505/ERCCl通路的表达情况;3、合成CASC9的短发夹RNA,用Lipo-2000转染进胃癌细胞系MGC-803和MKN-45中,然后收集细胞,然后通过qPCR实验检测CASC9的表达情况;CCK8实验检测细胞活力情况;EdU实验检测细胞增殖情况;迁移小室实验检测细胞迁移情况;4、分别进行下列实验:1)合成CASC9的短发夹RNA,用Lipo-2000转染进胃癌细胞系MGC-803和MKN-45中,然后收集细胞,然后通过qPCR实验检测miR-505的表达情况;2)双荧光素酶报告基因检测CASC9与miR-505之间的结合;3)合成miR-505模拟物以及抑制剂用Lipo-2000转染进胃癌细胞系MGC-803和MKN-45中,然后收集细胞,然后通过qPCR实验检测miR-505以及ERCC1的表达情况并通过WB实验检测ERCC1的表达情况;4)双荧光素酶报告基因检测miR-505和ERCC1之间的结合;5)用Lipo-2000分别将对照短发夹RNA、CASC9的短发夹RNA、CASC9的短发夹RNA+miR-505抑制剂转染进胃癌细胞系MGC-803和MKN-45中,然后收集细胞,然后通过qPCR、WB实验检测ERCC1的表达情况;5、用Lipo-2000分别将对照短发夹RNA、CASC9的短发夹RNA、CASC9的短发夹RNA+miR-505抑制剂、CASC9的短发夹RNA+miR-505抑制剂+ERCC的短发夹RNA转染进胃癌细胞系MGC-803和MKN-45中,然后收集细胞,然后通过CCK8实验检测细胞活力情况;EdU实验检测细胞增殖情况;迁移小室实验检测细胞迁移情况。结果:1、CASC9在胃癌患者癌组织样本中的表达水平显著高于癌旁健康组织样本中的表达水平:20例样本中有17例病人的CASC9在癌组织中的RNA表达水平比相应的癌旁健康组织中高;miR-505在胃癌患者癌组织样本中的表达水平显著低于癌旁健康组织样本中的表达水平:20例病人中有18例病人的miR-505癌组织中的表达水平比相应的癌旁健康组织中低;ERCC1在胃癌患者癌组织样本中的表达水平显著高于癌旁健康组织样本中的表达水平:20例病人中有17例病人的癌组织中的ERCC1的蛋白表达水平比相应的癌旁健康组织中高;2、与正常人胃粘膜上皮细胞株GES-1相比,CASC9在胃癌细胞SGC-7901、MKN-45、HGC-27和MGC-803中表达上调;与正常人胃粘膜上皮细胞株GES-1相比,miR-505在胃癌细胞SGC-7901、MKN-45、HGC-27和MGC-803中表达下调;与正常人胃粘膜上皮细胞株GES-1相比,ERCC1在胃癌细胞 SGC-7901、MKN-45、HGC-27 和 MGC-803 中表达上调;3、CASC9 的短发夹RNA能够有效减低胃癌细胞系MKN-45和MGC-803中CASC9的表达;抑制CASC9的表达能显著降低胃癌细胞系MKN-45和MGC-803的细胞活力、增殖能力以及迁移能力;4、分为如下部分:1)抑制CASC9的表达并不能调控miR-505的表达水平;2)双荧光素酶报告基因显示CASC9能够有效结合miR-505;3)miR-505模拟物能够显著升高miR-505的量并抑制ERCC1的表达,而miR-505抑制剂能够显著减低miR-505的量并上调ERCC1的表达;4)双荧光素酶报告基因显示ERCC1能够有效结合miR-505;5)抑制CASC9的表达能够显著抑制ERCC1的表达,而miR-505抑制剂能够降低其效应;5、调控CASC9/miR-505/ERCCl通路能够影响胃癌细胞活力、增殖以及迁移能力。结论:本研究表明CASC9/miR-505/ERCC1在胃癌组织中表达异常,并进一步阐明CASC9通过与ERCC1竞争性结合miR-505,上调ERCC1的表达,进而促进胃癌细胞的生长与迁移能力。
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