盐酸小檗碱对采后柑橘指状青霉和酸腐病菌的抑菌机理初探

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柑橘是我国重要的经济作物,以其独特的风味和营养受到大众的青睐。柑橘果实在运输和贮藏过程中面临病原真菌的侵染,化学杀菌剂的使用是目前最有效的防治手段,但其造成的问题(如人身健康、环境问题以及病原菌耐药性增加)也日益严峻。因此急需开发新型防治手段代替化学杀菌剂。盐酸小檗碱(berberine hydrochloride,BH)是一种异喹啉类季铵盐,在果蔬采后病害防治中已有初步探究,本论文通过离体和活体实验评估BH对指状青霉及酸腐病菌的抑菌作用及对柑橘采后绿霉病和酸腐病的防治效果;利用扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)观察BH对菌丝体及孢子表面形态的影响,进一步从真菌细胞壁、细胞膜、活性氧(ROS)和能量代谢等方面探究BH对病原真菌可能的抑菌机制,主要结果如下:1.BH对指状青霉的抑菌活性及抑菌机理离体条件下,BH抑制指状青霉生长的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimum fungicidal concentration,MFC)分别为0.16 g/L、0.32 g/L;且BH处理能显著抑制孢子萌发。活体实验结果显示,5×MFC、10×MFC BH可有效降低柑橘果实绿霉病发病率并延缓发病进程。SEM结果表明,BH处理使指状青霉菌丝体干瘪褶皱,扭曲变形。进一步研究发现,BH影响孢子细胞壁完整性但不影响细胞膜通透性。BH处理30 min时,指状青霉菌丝体细胞壁完整性被破坏,表现为钙荧光白(Calcofluor white,CFW)染色后的荧光强度减弱以及胞外碱性磷酸酶活力显著升高;且菌丝体细胞膜通透性也受损,表现为碘化吡啶(Propidium iodide,PI)染色后呈现红色荧光,且电导率和可溶性蛋白含量均急剧上升;同时,菌丝体能量代谢也受到影响,表现为胞内ATP和能荷急剧下降。BH处理60 min时,菌丝体胞内ROS水平升高,MIC BH处理组胞内丙二醛含量显著上升,发生膜脂过氧化。同时,线粒体膜电位下降,ATP含量及能荷较30 min时进一步降低。说明BH先损伤指状青霉的细胞壁完整性及细胞膜通透性,导致胞内物质泄漏,并影响能量代谢。随后,ROS积累造成膜脂过氧化现象和线粒体损伤,进一步造成能量代谢失衡。2.BH对柑橘酸腐病菌的抑菌活性及抑菌机理离体实验表明,BH抑制酸腐病菌生长的MIC和MFC分别为0.08 g/L、0.16g/L,且BH能显著抑制酸腐病菌的孢子萌发。活体实验表明,BH可以有效降低柑橘果实发病率,延缓酸腐病的发病进程。BH对酸腐病菌菌丝体和孢子呈现不同的抑制作用。SEM结果表明,BH处理不影响菌丝体的表面形态,但造成孢子的塌陷和畸形;CFW和PI染色结果表明,BH不影响菌丝体细胞壁完整性和孢子细胞膜通透性,但3 h时孢子的细胞壁完整性受损。推测BH主要是通过破坏孢子的细胞壁完整性抑制酸腐病菌的生长。进一步实验发现,BH处理3 h时,酸腐病菌孢子细胞壁成分几丁质的含量显著低于对照组,并随处理时间的延长而持续下降;9 h时,几丁质合成酶基因CHS1、CHS2、CHS3表达量均不同程度下调,而几丁质脱乙酰酶基因CDA1的相对表达量上调。另外,孢子细胞壁成分β-1,3-葡聚糖的含量在处理9 h时显著低于对照组,同时β-1,3-葡聚糖合成相关基因FKS1及外切-β-1,3-葡聚糖酶基因EXG1的表达量下调,但内切-β-1,3-葡聚糖酶基因BGL2的相对表达量与对照组无显著性差异。说明BH通过影响细胞壁成分几丁质和β-1,3-葡聚糖的合成抑制酸腐病菌孢子的萌发。
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