[研究背景]慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD,慢阻肺)患病率高,危害性大。已知吸烟、汽车尾气、生物燃料等空气污染物暴露是慢阻肺的重要危险因素;二氧化氮(Nitrogen Dioxide,NO2)是空气污染物中影响慢阻肺发生发展的主要有害气体,但对其致肺损害作用的病理机制认识不足。[研究目的]本论文应用人群、动物、细胞样本结合分子生物学方法,研究急、慢性NO2暴露所引起的肺损害效应,研究NO2暴露对外周血单个核细胞和肺组织等样本中基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制剂(TIMPs)表达的调控作用及机制。[研究方法]本论文研究分为四个部分:第一部分:NO2急、慢性暴露的肺损伤作用。建立NO2急、慢性暴露的大鼠模型,收集肺组织、血液及支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid,BALF)等样本,小动物肺功能仪(BUXCO公司PFT系统)检测大鼠肺功能;HE染色检测大鼠肺组织病理;ELISA等方法检测血液及BALF中炎症因子等水平;生化方法检测血凝、血脂及血糖水平等。第二部分:NO2慢性暴露对MMPs及其抑制剂TIMPs表达的影响。建立NO2慢性暴露的大鼠模型,8-羟基脱氧鸟苷(8-OhdG)ELISA方法检测肺组织氧化应激水平;3-硝基酪氨酸(3-NT)ELISA方法检测肺组织硝化应激水平;免疫蛋白印迹和ELISA方法检测MMPs及其抑制剂TIMPs的表达。第三部分:MMPs/TIMPs基因突变与慢阻肺发病风险的关联性研究。收集慢阻肺家系,Illumina全基因组测序方法对慢阻肺家系患者进行全基因组测序,筛选家系内部和家系间共有MMPs/TIMPs基因突变位点;并应用SNPscan基因分型方法对筛选出的突变位点做慢阻肺人群的大样本验证,通过回归等统计方法进行突变位点与慢阻肺发病风险的关联分析。第四部分:MMP16 rs2664370 T>C突变位点的功能研究。围绕“MMP16—has-miR-576-5p—生物学功能”研究MMP16是否通过hsa-miR-576-5p进而影响了慢阻肺的发生发展。[研究结果]第一部分:1)选择20 ppm NO2作为NO2慢性暴露建立慢阻肺模型的参考浓度;2)20 ppm NO2慢性暴露75天时,大鼠出现慢阻肺表型;3)NO2慢性暴露75天慢阻肺模型组血TG,RBC,HGB,HCT,MCV及MPV指标均高于对照组(P<0.05),NO2停止暴露后,状况所好转(P>0.05);4)血GLU水平随暴露时间增加而升高,NO2停止暴露后,仍持续上升(P<0.05);5)NO2停止暴露后,肺功能未出现进行性加重(P>0.05)。第二部分:1)MMP16可能是慢阻肺的生物标志物之一;2)NO2暴露的大鼠和细胞模型中没有发生硝化应激(P>0.05),氧化应激并不十分显著;3)MMP16在慢阻肺大鼠组织高表达(P<0.05);4)外界有害气体或颗粒物[NO2,PM2.5(Fine Particulate Mater)及烟草烟雾提取物(Cigarette Smoke Extract,CSE)]刺激均能引起MMP16的表达增高(P<0.05)。第三部分:1)MMP16rs2664370T>C突变位点是家系内部和家系间的共有突变;2)散发大样本验证的关联分析中发现,慢阻肺患者和正常对照在吸烟状况、慢阻肺家族史、累积X射线照射次数、有害物质接触史及住房条件存在显著性差异(P<0.05);3)rs2664370 T>C遗传方式为隐性遗传且纯合突变型rs2664370 CC为保护性突变,该位点与年龄存在交互作用;4)rs2664370 CC可能通过改善患者的ABE水平而对患者起到保护作用(P<0.05)。第四部分:1)慢阻肺患者血浆MMP16的表达水平高于正常对照;2)MMP16 rs2664370 CC基因型慢阻肺患者血浆MMP16的表达水平低于rs2664370 TC+TT基因型;3)MMP16可能与hsa-miR-576-5p相关。[研究结论]1.20 ppm NO2急性暴露能够引起大鼠气道炎症和体重下降;2.20 ppm NO2慢性暴露能够诱导大鼠慢阻肺,增加肺组织MMP16的表达水平;3.慢阻肺患者血浆MMP16水平升高;4.MMP16 rs2664370 CC可能通过降低ABE水平,而对患者起到保护作用;5.MMP16 rs2664370 CC 可能通过与 hsa-miR-576-5p 结合,降低了 MMP16蛋白的表达。