软枣猕猴桃AaMYB16转录因子响应冻胁迫的功能解析

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软枣猕猴桃是一种我国北方常见的野生果树,具有较高的经济价值,由于纬度影响,低温胁迫在我国北方频频发生,对植物的生长发育、产量和品质均产生了负面影响。本试验以北方常见的经济植物软枣猕猴桃为研究对象,利用分子生物学、植物生理学、生物化学等技术手段,克隆了AaMYB16基因,对AaMYB16蛋白进行亚细胞定位,构建植物表达载体GV1300-AaMYB16,瞬时转化离体软枣猕猴桃叶片和稳定遗传转化拟南芥,挖掘AaMYB16蛋白的互作蛋白,对软枣猕猴桃中响应冻胁迫的R2R3-MYB转录因子的功能进行解析。主要研究结果如下:1、软枣猕猴桃AaMYB16基因全长1200 bp,编码399个氨基酸,属于R2R3-MYB基因家族。系统进化树显示该蛋白与山梨猕猴桃、美味猕猴桃、葡萄中的同源蛋白的进化关系较近。2、构建GV1300-AaMYB16瞬时侵染洋葱表皮和烟草叶片进行亚细胞定位,结果显示AaMYB16:GFP定位于细胞核。冻胁迫下,离体转基因软枣猕猴桃叶片中的ROS积累量高于对照,低温胁迫相关基因Aa CBF、Aa Gol S、Aa KIN1、Aa SAG21、Aa COR47的相对表达量均低于对照;转基因拟南芥的存活率、叶片含水量、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和超氧化物歧化酶(SOD)酶活性、脯氨酸含量、叶绿素含量、花青素含量均低于对照;叶片萎蔫率、离子渗透率、叶片中ROS的积累量、丙二醛(MDA)含量均高于对照。低温胁迫相关基因At CBF1、At CBF2、At CBF3、At KIN1、At COR47的相对表达量均低于对照。结果说明AaMYB16能够响应冻胁迫,并且过量表达AaMYB16基因使离体软枣猕猴桃叶片和拟南芥的抗冻性减弱,具有负调控CBF低温信号传导的功能。3、构建pGBKT7-AaMYB16酵母表达载体、p SPYNE-AaMYB16双分子荧光互补表达载体、p CAMIA1300-n LUC-AaMYB16双荧光素酶表达载体分别进行酵母双杂交试验、双分子荧光互补试验和双荧光素酶试验验证AaMYB16与bHLH蛋白的互作关系,结果显示:AaMYB16蛋白有自激活活性,AaMYB16蛋白与AabHLH18蛋白不存在相互作用关系,AaMYB16蛋白与AabHLH137蛋白存在相互作用关系。
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