论文部分内容阅读
通过影响细胞内叶酸代谢过程中的重要酶,达到抗肿瘤目的方法,一直是药物化学家研究的重点。在人体叶酸代谢过程中,只有四氢叶酸具有生理功能,二氢叶酸需经过二氢叶酸还原酶（DHFR）催化还原为四氢叶酸（FH4）才能被人体所利用。四氢叶酸是一碳单元的传递体,使得胸苷合成酶（TS）能够催化2’-脱氧脲苷5’-单磷酸盐（d UMP）还原甲基化转变为2’-脱氧胸苷-5’-单磷酸盐（d TMP）,是d TMP从头合成的唯一途径。除了参与核酸的合成以外,四氢叶酸还参与体内其他重要化合物的生成和代谢。在肿瘤细胞快速增长过程中,如果DHFR和TS受到抑制,肿瘤细胞会因缺乏胸腺嘧啶而死亡,因此这两种酶已成为癌症化疗的重要靶点。甲氨蝶呤（MTX）[1]和培美曲塞（PMX）是临床广泛使用的叶酸拮抗剂,分别主要抑制DHFR和TS从而达到抗肿瘤的效果。MTX的化学结构与叶酸相似[2],通过竞争性抑制DHFR,阻断二氢叶酸还原为四氢叶酸,导致了一碳单位的供体减少,使得DNA,RNA和蛋白质的合成受到抑制,导致肿瘤细胞死亡。MTX在细胞内可形成多聚谷氨酸盐的形式,使MTX长期存在于细胞内,易产生蓄积毒性。DHFR基因突变,使MTX对其亲和力下降,致使肿瘤细胞易产生耐药性。因此,叶酸拮抗剂抗肿瘤药物的研究主要集中于设计和开发多靶点非经典叶酸拮抗剂,从而提高药物的选择性并克服易产生耐药性的缺点。本课题基于课题组前期工作发现的多靶点先导化合物A,设计合成了一系列2-氨基-4-氧-6-取代吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物,经体外抗肿瘤活性测试、作用机制及分子模拟研究,所合成的目标化合物均可作为潜在抗肿瘤药物。目的:建立2-氨基-4-氧-6-取代吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物的合成方法,完成目标化合物的合成,优化反应条件,并对目标化合物进行体外抗肿瘤生物活性测试、作用机制及分子模拟研究。方法:以4-氯乙酰乙酸乙酯（13）为原料[3]与2,6-二氨基-4-氧嘧啶合环得2-（2-氨基-4-氧-3,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶）乙酸乙酯（15）。中间体15经三乙基硼氢化锂（Li Et3BH）还原得2-氨基-6-（2-羟乙基）-3,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-酮（16）。中间体16以甲基磺酰氯为磺酰化试剂,制得中间体（2-氨基-4-氧-3,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基）乙基甲磺酸酯（17）。中间体17与叠氮化钠发生亲核取代反应得关键中间体2-氨基-6-（2-叠氮乙基）-3,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-酮（18）,使用Pd/C,氢气将叠氮基还原为氨基得到化合物19,化合物19在缩合体系HOBt/EDCI作用[4]下,分别与邻位,间位,对位苯二甲酸单甲酯发生缩合反应,碱性条件下水解调酸分别得到关键中间体29,22,26,中间体29,22,26分别与2,3,4位氨甲基吡啶在缩合体系HOBt/EDCI作用下缩合得到非经典叶酸拮抗剂1-9。关键中间体29,22,26分别在N-甲基吗啉（NMM）和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪（CDMT）的催化下与L-谷氨酸二乙酯盐酸盐缩合,经过水解并酸化后分别得到经典叶酸拮抗剂10,11,12。通过高分辨质谱、核磁共振氢谱和碳谱等方法对各重要中间体和目标化合物进行结构确认。选用口腔表皮样癌细胞（KB）、结肠癌细胞（SW620）和非小细胞肺癌细胞（A549）为试验对象,并以经典叶酸拮抗剂MTX和PMX作为阳性对照药,对目标化合物1-9的体外抗肿瘤活性进行测试,同时开展核苷酸保护试验和二氢叶酸还原酶抑制试验以确定目标化合物的分子内作用靶点。运用MOE（2014.09）分子模拟软件对化合物进行分子对接试验,进一步阐释目标化合物的作用机制。结果:按照所设计的合成路线成功合成目标化合物1-12,通过MS、1H-NMR和13C-NMR对重要中间体及目标化合物进行了结构确认,并对合成路线进行了优化。完成化合物1-9的体外抗肿瘤活性测试、作用机制及分子模拟研究。结论:所有目标化合物对KB,SW620和A549肿瘤细胞系均表现出抑制活性。该系列化合物1-3是对KB细胞更好的抑制剂。核苷保护试验和二氢叶酸还原酶抑制试验表明化合物1-3是DHFR抑制剂。靶标化合物1和3不是周期特异性药物,分子对接结果与生物活性和作用机制试验结果一致。