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团头鲂(Megalobrama amblycephala),作为我国重要的鲤形目、鲌亚科、鲂属中的重要的代表性的淡水养殖经济物种,由于食性广、养殖成本低廉,成活率高等优良品质而受到推广。2018年渔业统计年鉴显示团头鲂的2017年总产量达到80万吨。团头鲂性成熟周期较长,传统的育种方式需要较高的成本和较长的时间,团头鲂基因组中存在大量未知功能的主效基因,解读它们的功能对认识团头鲂生殖、生长、发育及抗逆(病)等经济性状具有重要的理论意义和应用价值。细胞因子信号传导抑制蛋白1(SOCS1)是一种重要的反馈调节因子,广泛参与调控多种细胞因子介导的信号通路,对于免疫系统的调节和生物体的生长发育都发挥着至关重要的作用。目前虽已对几个硬骨鱼类进行研究,相较于对哺乳动物SOCS1的广泛研究,对于非哺乳类脊椎动物的结构、表达、和生理功能却知之甚少。本文对团头鲂重复基因socs1的结构、表达和功能初步研究:1.本研究采用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了团头鲂SOCS1a和SOCS1b基因cDNA的全长序列,SOCS1a基因全长为1065bp,编码201个氨基酸;SOCS1bc基因全长为817 bp,共编码197个氨基酸。团头鲂SOCS1s蛋白序列在其他脊椎动物中被发现有高度同源性,特别是在SH2域和SOCS box中。团头鲂SOCS1a和SOCS1b与斑马鱼的SOCS1a和SOCS1b序列相似性较高,分别为85%和81%,可见socs1在进化上是比较保守的,但是两个同源基因的氨基酸之间相似度仅为49%。不同胚胎时期RT-PCR结果表明团头鲂SOCS1a和-1b mRNA从受精卵开始到胚胎发育至44小时为止,相对的表达量处于浮动的状态。SOCS1a的表达水平相对较低从在受精后8小时前,随后在受精后的12小时表达量转录显著增长,突然达到到中等水平,并且直到受精36小时后最终达到最大值。在胚胎发育过程中,SOCS1b的表达与SOCS1a有相似的趋势。整胚原位杂交结果显示,SOCS1a和SOCS1b主要在脑部表达比较明显在12hpf和24 hpf时,在36hpf时,这两个基因在脊索和脑部两个区域被检测到,不同的是SOCS1b在脊索处表达较为微弱。在成年团头鲂中,SOCS1a和-1b mRNA均在大部分组织中能够被检测到。SOCS1a基因较高的表达于脾脏中,而在肠道、肝脏中表达较少。SOCS1b基因在肌肉和脾脏中有较高的表达,在皮肤,心脏和肝脏中较低表达。通过注射外源生长激素处理探究hGH对团头鲂socs1表达调控的影响,团头鲂SOCS1a和SOCS1b mRNA在肝脏中瞬时上调,表达量增长了大约10倍,直至3h后上升至最大值后下降至原始值。同样的,hGH对团头鲂SOCS1s在肾脏和肌肉中的表达变化也是相似的。2.本实验以已获得的团头鲂SOCS1a和SOCS1b基因为编辑对象,在线分析筛选出合适的靶点合成gRNA(guide RNA),其中含有的主位点序列,负责识别靶基因/靶序列;Cas9负责切割靶点,造成DNA双链断裂(DSB)。然后对1-2细胞期的团头鲂胚胎进行gRNA和Cas9蛋白的混合注射。通过对SOCS1a和SOCS1b靶点进行筛选,最终得到效率较高的靶点。SOCS1a酶切效率较高的靶点是SOCS1a-靶2,大致的酶切效率在35%左右,SOCS1a-靶1的酶切效率为20%,而SOCS1b效率较高的靶点是SOCS1b-靶2,大致的酶切效率在25%左右,SOCS1b-靶2的酶切效率为20%。通过对三月龄已敲除个体团头鲂个体进行检测,发现SOCS1a和SOCS1b基因的碱基都出现缺失和错位,并且利用荧光定量检测发现其表达量减少50%左右,表明CRISPR/Cas9系统对SOCS1基因的敲除是有效的,利用T7E1酶法成功筛选出存在靶点序列突变的F0代个体。与野生型(WT)相比,SOCS1a和SOCS1b杂合突变品系团头鲂生长性能增强、体重显著增加,同时炎症因子TNF-α和IL-6显著增加,而IL-1β表达无明显变化。随即通过嗜水气单胞菌对敲除SOCS1团头鲂突变品系进行攻毒试验,与野生型不同的是,SOCS1a和SOCS1b杂合突变体中都出现IL-6和TNF-αmRNA水平持续显著增加的现象。本实验通过CRISPR/Cas9系统成功敲除了团头鲂SOCS1a和SOCS1b基因,为进一步探讨SOCS1基因的作用提供了一定的研究基础。同时,也为以养殖鱼类为对象的研究,合理选用CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了依据和借鉴。