1996年，Sonoda(Cancer,1996)等建立了一种子宫腺癌细胞系SiSo，他们将SiSo免疫小鼠，利用杂交瘤技术制备了一系列单克隆抗体，发现了一种可被22-1-1单抗识别的新蛋白，分子量为40kD和78kD(认为78KD蛋白为40KD蛋白的二聚体)，命名为22-1-1抗原，该抗原不同于以往发现的YH206，GA733，CA125，CEA等肿瘤抗原，认为是一种新的肿瘤相关抗原。Watanabe(MolCellBiol,1998)等在1998年从人乳腺癌细胞系MCF-7cDNA文库中克隆到一个雌激素反应性的新基因，命名为EBAG9(Estrogenreceptor-bindingfragment-associatedgene9)，编码区为639bp，在5’上游有一个雌激素反应元件，该分子mRNA和蛋白的表达随雌激素的诱导而上调。Nakashima(NatMed,1999)等分离鉴定出编码22-1-1抗原的基因命名为RCAS1(receptor-bindingcancerantigenexpressedonSiSocells)，基因序列比对后发现RCAS1同EBAG9实际上是同一种蛋白质。 关于RCAS1分子的大多数研究是用22-1-1单抗通过免疫组化实验分析在各种临床肿瘤组织标本中(如宫颈癌、侵袭性宫颈鳞状上皮癌、乳腺癌、T3胃癌等)的表达，认为RCAS1的表达与肿瘤的分化、侵袭性和恶性程度呈正相关，并提示不良预后，RCAS1在正常组织中没有表达。RCAS1可作为肿瘤恶性程度的诊断指标以及独立的预后因素。 第一部分：GST-RCAS1融合蛋白的表达、纯化和鉴定 目的构建RCAS1的重组质粒pGEX-2T/RCAS1、原核表达GST-RCAS1融合蛋白并进行纯化和鉴定。 方法从MCF-7细胞提取总RNA，通过RT-PCR得到RCAS1的扩增产物，纯化后用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切。选择pGEX-2T作为载体，用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后与上述酶切后DNA连接，转化感受态JM109大肠杆菌并铺氨卞青抗性LB培养平皿。 结论成功构建RCAS1的重组表达质粒并表达纯化得到GST-RCAS1融合蛋白，通过WB试验鉴定，初步判断22-1-1Ag与RCAS1蛋白是不同的抗原。 第二部分膜分子RCAS1在诱导免疫细胞凋亡的作用 目的研究RCAS1分子对免疫细胞的凋亡诱导作用以及生长抑制作用，对相关细胞的RCAS1受体进行检测，分析RCAS1诱导细胞凋亡的可能机制。 方法1、对Ad-RCAS1重组腺病毒进行鉴定。分别用Ad-RCAS1和Ad-LacZ感染HeLa细胞，提取mRNA进行RT-PCR鉴定，提取蛋白用22-1-1Ab和RCAS1多抗进行WB鉴定RCAS1分子的表达。2、细胞凋亡检测。3、细胞表面的putativeRCAS1受体的检测。4、生长抑制实验。用MTT实验检测RCAS1对Jurkat、K562细胞生长的抑制作用。5、RCAS1表达同糖原合成酶激酶GSK3β和phGSK3β(磷酸化GSK3β)表达的相关性检测。 结论1、再次证明22-1-1抗原与RCAS1抗原不是同一种蛋白。2、RCAS1能与其putative受体结合而诱导激活的T细胞及K562、Jurkat等免疫细胞来源的细胞系发生凋亡。3、RCAS1受体是一种能被诱导表达的受体。4、RCAS1对Jurkat、K562的细胞生长有一定的抑制作用。5、RCAS1诱导k562细胞凋亡可能与其引起GSK3β活性下调从而导致NF-κB信号途径受到抑制有关。 第三部分雌孕激素影响人乳腺癌细胞系MCF-7表达RCAS1的研究 目的探讨雌激素(17β-estradiol)或孕激素(Progesterone)对人乳腺癌细胞MCF-7表达RCAS1分子的影响。 方法1、浓度依赖实验。用浓度为10-12～10-8mol/L的雌激素或浓度为10-9～10-5mol/L的孕激素作用乳腺癌细胞MCF-7细胞后，用半定量RT-PCR检测MCF-7细胞RCAS1mRNA水平的变化，用western印迹实验分析MCF-7细胞表达RCAS1分子蛋白水平的变化。 结论雌激素可上调MCF-7细胞的RCAS1分子的表达，孕激素可下调MCF-7细胞的RCAS1分子的表达。 第四部分RCAS1的表达与小鼠高转移性乳腺癌生长和转移的相关性研究 目的建立稳定过表达RCAS1的4T1小鼠高转移乳腺癌细胞株，根据mRCAS1的序列设计其siRNA对RCAS1基因进行沉默，利用小鼠高转移性乳癌模型探讨RCAS1的表达与乳腺癌生长和转移的相关性，并初步探讨其相关的免疫机理。 方法1、构建小鼠RCAS1过表达的细胞株。从4T1细胞的提取总RNA通过RT-PCR得到小鼠RCAS1的PCR产物，纯化后用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切。2、siRNA设计和筛选。根据小鼠RCAS1序列设计3条siRNA进行瞬时转染4T1细胞，并在实验中以NonsilencingsiRNA为阴性对照和GAPDHsiRNA为阳性对照。3、4T1细胞的体外生长抑制实验。4、乳腺癌模型的建立和实验动物的处理。5、相关指标测定。将测定的肿瘤大小用公式V=longestdiameter×smallestdiameter2计算肿瘤的体积，并统计分析各组肿瘤大小的差别。 结论：成功建立过表达4T1/RCAS1细胞株，成功筛选得到对RCAS1有基因沉默作用的siRNA。体内实验结果表明RCAS1的过表达可促进乳腺癌的生长和转移，用siRNA抑制RCAS1表达能抑制肿瘤的生长和转移。RCAS1诱导T淋巴细胞凋亡，使得肿瘤局部淋巴细胞浸润不足，CTL活性下降可能是其促进肿瘤的生长和转移的机制。