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霉菌毒素是产毒霉菌产生的有毒代谢产物,危害广泛且污染严重,呕吐毒素（Deoxynivalenol,DON）是最常见的霉菌毒素之一,对奶牛健康与奶业发展均构成严重威胁。乳腺上皮细胞是乳汁产生的场所,目前DON对乳腺上皮细胞的毒性研究主要集中在细胞增殖、炎症反应和氧化应激等方面,而对乳成分的合成以及泌乳功能的影响尚不清楚。因此,本研究一方面以奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T为材料,采用q RT-PCR、Western Blot、免疫细胞荧光、ELISA、流式细胞术等技术探究DON对奶牛乳腺上皮细胞的毒性作用及潜在机制,并采用RNA-seq技术研究DON对MAC-T细胞转录组的影响。另一方面,以昆明系小鼠为模式动物,从活体水平揭示DON对小鼠乳腺组织与泌乳功能的影响。本研究主要结果如下:一、DON对奶牛乳腺上皮细胞增殖、紧密连接以及乳成分合成的毒性作用研究（1）DON对MAC-T细胞活力与细胞凋亡的影响将1、5、10μM DON处理MAC-T细胞24、48、72 h后,CCK-8结果显示除1μM DON处理24 h外,DON处理组细胞活力均显著下降,且呈明显的剂量依赖关系。细胞计数结果同样显示DON会显著减少MAC-T细胞数量。凋亡结果显示,不同浓度DON均会诱导MAC-T细胞早期凋亡,且呈明显的时间-剂量依赖关系。（2）DON对MAC-T细胞骨架的影响采用间接免疫荧光对MAC-T细胞的微丝（F-actin）与微管（α-tubulin）染色,结果显示,对照组细胞形态与微管结构正常,微丝排列有序,但DON处理后细胞发生皱缩,微丝排列紊乱,微管结构异常。（3）DON对MAC-T细胞通透性以及紧密连接的影响乳酸脱氢酶检测结果显示,浓度为5、10μM DON处理MAC-T细胞24、72h后,乳酸脱氢酶活力显著上升,且呈明显的剂量依赖关系。跨膜电阻结果显示,加入不同浓度DON处理6 h后,跨膜电阻值均有显著下降;处理24 h后,1、5、10μM DON处理组分别下降14.14%、14.64%与16.97%。q RT-PCR结果显示5μM DON处理24、48与72 h后,Claudin-3与Claudin-4基因表达量均有显著下降。（4）DON对MAC-T细胞乳脂合成及相关调控基因的影响采用Bodipy对MAC-T细胞脂质进行染色,结果显示,DON处理MAC-T细胞后,脂质荧光强度呈时间-剂量依赖性减弱,其中10μM DON处理72 h后荧光强度最弱,为对照组的44.64%。q RT-PCR结果显示,LEPTIN基因表达量在10μM DON处理后显著上升,而FASN与ACSS2基因表达量在5μM DON处理48、72 h后显著下降。（5）DON对MAC-T细胞乳蛋白合成及相关通路蛋白的影响采用ELISA法检测MAC-T细胞中酪蛋白的合成。结果显示,不同浓度DON处理MAC-T细胞24、48与72 h后,除5μM DON处理24 h外,α-酪蛋白均有显著下降;5μM DON处理后β-酪蛋白均有显著下降;10μM DON处理后κ-酪蛋白均有显著下降。Western blot（WB）结果显示,5μM DON处理MAC-T细胞24 h后,JAK2、STAT5、m TOR、4EBP1总蛋白水平无明显变化,但是磷酸化水平均显著降低。（6）DON对MAC-T细胞转录组的影响RNA-seq结果显示,5μM DON处理后,实验组与对照组间共筛选出1732个上调基因与2012个下调基因。GO分析结果显示,上调的差异基因主要富集于细胞增殖负调控、细胞对生长因子刺激的反应、转录因子活性等功能注释,而下调基因主要富集于脂质生物合成过程、细胞修饰氨基酸代谢过程、核糖体的结构成分和甾醇生物合成过程等注释;KEGG分析结果显示差异基因主要富集于核糖体、谷胱甘肽代谢和类固醇生物合成等通路。二、DON对昆明小鼠泌乳功能的毒性作用研究（1）DON对小鼠泌乳以及乳腺形态的毒性作用对昆明小鼠采取2 mg/kg/d DON灌胃处理,从产后第1 d开始灌胃,结果显示,在产后第5 d与第7 d,实验组母鼠的泌乳量显著下降,而灌胃第9 d后处理组泌乳量有所回升。HE染色结果显示,产后第7 d,对照组乳腺结构正常,未见变形和炎症细胞浸润现象,而实验组乳腺腺泡变小,小叶间质明显变厚;产后第21 d,对照组乳腺腺泡体积变小,而实验组小鼠乳腺小叶间质进一步增厚。（2）DON对小鼠泌乳相关激素的影响ELISA结果显示,DON处理后血清中雌激素与孕酮水平在产后第7 d显著下降,催乳素水平在第21 d显著下降,生长激素水平在第7 d显著上升。（3）DON对小鼠乳腺凋亡与紧密连接蛋白的影响TUNEL染色结果显示,在产后第7 d与产后第21 d DON处理组乳腺凋亡细胞均显著增多;WB结果显示DON处理后cleaved-Caspase-3与Caspase-3蛋白表达量显著上升、Bcl-2蛋白表达量显著下降;组织荧光染色结果显示,DON处理后7d乳腺细胞中Occludin蛋白的平均荧光强度显著下降。综上所述,DON能显著降低MAC-T细胞活力,诱导细胞凋亡,破坏细胞骨架与紧密连接,抑制乳脂合成与相关基因的表达,抑制乳蛋白合成与相关信号通路蛋白的磷酸化。此外,DON还能降低小鼠泌乳量,造成乳腺结构损伤,影响泌乳相关激素水平并诱导小鼠乳腺细胞的凋亡。本研究能为阐明霉菌毒素对泌乳的毒性作用奠定理论基础,同时为降低饲料中霉菌毒素的污染敲响警钟。