论文部分内容阅读
三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）广泛分布于韩国、日本、中国和东南亚沿海,是我国重要的海产经济蟹类。micro RNA（mi RNA）是一类具有重要功能的非编码RNA,能够与靶基因m RNA的3’非翻译区（UTR）互补结合,降解其m RNA或抑制其翻译。已有研究表明,mi RNA在甲壳动物卵巢发育和成熟中发挥至关重要的作用。目前,有关mi RNA对三疣梭子蟹卵巢发育调控作用的认知还很有限。本文从靶向甲壳动物重要生殖激素—甲基法尼酯（MF）代谢途径以及卵巢发育相关重要基因foxl2的mi RNA入手,研究了mi RNA介导的三疣梭子蟹卵巢发育调控机制。研究结果有助于深入理解三疣梭子蟹性腺发育调控机制,为研发生殖调控新技术奠定了理论基础。本论文研究为以下两个方面:1.靶向甲基法尼酯代谢途径的mi RNA在三疣梭子蟹卵巢发育中的作用研究通过生物信息学方法预测了靶向三疣梭子蟹MF代谢途径的mi RNA,并从体内和体外水平验证了mi RNA对其预测靶基因的调控作用。Target Scan软件预测结果显示,let-7-5p、mi R-141-5p、mi R-276-5p和novel-72等4个mi RNA可能靶向调控三疣梭子蟹MF代谢。利用双荧光素酶报告基因检测实验在体外水平验证mi RNA对MF的调控作用。实验结果表明,let-7-5p和mi R-141-5p分别能够与MF分解途径关键酶—Juvenile hormone esterase-like carboxylesterase-1（JHE-like-CXE 1）和Juvenile hormone esterase-like carboxylesterase-2（JHE-like-CXE 2）基因的3’UTR区域靶向结合。通过分析过表达和抑制mi RNA对其靶基因表达的影响,从体内水平验证let-7-5p和mi R-141-5p对其靶基因的调控作用。结构显示,注射let-7-5p agomir和mi R-141-5p agomir后,其靶基因的表达均显著降低;而注射let-7-5p antagomir和mi R-141-5p antagomir后,靶基因的表达均显著上升。上述结果表明,let-7-5p和mi R-141-5p能够靶向调控MF分解代谢途径。在明确let-7-5p和mi R-141-5p对JHE-like-CXEs调控作用的基础上,进一步分析了其在三疣梭子蟹卵巢发育调控中的作用。let-7-5p和mi R-141-5p在不同组织中的表达分析结果显示,这两个mi RNA均在MF分解代谢关键组织—肝胰腺中高表达,显著高于其他组织。let-7-5p、mi R-141-5p及其靶基因JHE-like CXE 1和JHE-like CXE 2在卵巢发育不同时期的表达分析结果表明,let-7-5p与肝胰腺中JHE-like CXE 1表达显著负相关,而mi R-141-5p与卵巢和肝胰腺中JHE-like CXE 2表达显著负相关。过表达和敲降实验结果显示,注射let-7-5p agomir和mi R-141-5p agomir后,发现MF滴度、Vtg基因表达显著增高;而注射let-7-5p antagomir和mi R-141-5p antagomir后,MF滴度、Vtg基因表达均显著降低。综合上述结果,证实let-7-5p和mi R-141-5p能够通过靶向调控MF分解代谢途径,进而调节三疣梭子蟹卵黄发生过程。2.靶向foxl2基因的mi RNA在三疣梭子蟹卵巢发育中的作用研究本实验探究了mi RNA对三疣梭子蟹生殖关键基因foxl2的调控作用。首先,克隆了三疣梭子蟹foxl2（Ptfoxl2）基因c DNA全长序列,该基因5′和3′非编码区域（UTR）长度分别为701 bp和211 bp,开放阅读框的长度为1590 bp。基因表达分析结果显示,Ptfoxl2在三疣梭子蟹不同组织中均有表达,但在卵巢中表达量最高;其在卵巢发育不同时期的表达存在显著差异,在V期表达量最高;切除眼柄后,该基因的表达出现显著下降;干扰foxl2基因后,卵巢Vitellogenin（Vtg）基因的表达显著上调。上述结果表明,Ptfoxl2可能在三疣梭子蟹卵巢发育调控中发挥重要功能,能够抑制卵巢组织中Vtg的合成。利用生物信息学方法,预测了靶向调控Ptfoxl2的mi RNA,并通过双荧光素酶报告基因检测实验,从细胞水平验证了这些mi RNA对Ptfoxl2的调控作用,分析了其在卵巢发育不同时期以及切除眼柄后的表达模式。结果显示,共转染mi R-9 mimics和包含Ptfoxl2 3′UTR的pmir GLO质粒组,萤火虫酶与海肾荧光素酶活性比值出现显著下降。卵巢发育过程及切除眼柄后,mi R-9与Ptfoxl2的表达模式呈显著负相关。该结果证实mi R-9可以从转录后水平调控三疣梭子蟹Ptfoxl2基因的表达。该论文有图27幅,表2个,参考文献107篇。