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第一章:Corin和ANP在小鼠肠道的表达分布研究目的:Corin是一种Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶,最初在心脏中发现,通过切割心房利钠肽前体（Pro-Atrial natriuretic peptide,Pro-ANP）,使其成为活化的 ANP起作用,发挥舒张血管、降低血压的功能。目前已证实corin在肾脏和皮肤汗腺中也有表达,起到促进水钠排泄的作用,参与维持机体电解质稳态。除肾脏和皮肤以外,肠道在维持机体电解质稳态中也发挥重要功能。但关于corin在小鼠肠道的分布及功能（尤其是结肠在钠吸收的功能）目前尚不清楚。本章我们研究corin和ANP在小鼠肠道的表达分布,为后续研究corin在结肠的功能提供基础。研究方法:1.取10-12周龄野生型（wild-type,WT）和corin基因敲除（knockout,KO）雄鼠,提取心脏、肾脏、肝脏、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、近端结肠及远端结肠的信使RNA（Messenger RNA,mRNA）。利用逆转录酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）的方法检测corin在WT和corin KO小鼠各组织的表达;2.利用 RT-PCR 检测Nppα、Npr1、Sncn1α、CftrmRNA 在 WT 和 corin KO 小鼠各组织的表达;3.取WT和corin KO小鼠肾脏和肠组织,用10%福尔马林固定,对切片组织进行苏木素-伊红（Hematoxylin and eosin,H＆E）染色、及免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）检测 corin、ANP 和 NPR-A 蛋白在小鼠肾脏和肠道组织的表达分布;4.利用免疫荧光染色（Immunofluorescence,IF）的方法检测corin、ANP和NPR-A蛋白在小鼠肠道的细胞定位。研究结果:1.Corin mRNA在小鼠肠道的表达:RT-PCR结果显示,Corin mRNA表达于WT小鼠的各段肠道;Corin KO小鼠中没有检测到Corin的表达;2.Nppα、Npr1、Scnn1α、Cftr mRNA在小鼠肠道的表达:RT-PCR结果显示,Nppα、Npr1、Scnn1α和Cftr在WT和corin KO小鼠的各段肠道均呈阳性表达;3.Corin、ANP和NPR-A蛋白在小鼠肾脏的表达分布:IHC和IF结果显示,在小鼠肾脏中,corin主要表达在近端小管的膜表面,ANP主要表达在近端小管细胞质内,NPR-A在细胞质和细胞膜上均有表达;4.Corin、ANP和NPR-A蛋白在小鼠肠道的表达分布:IHC结果显示,在小鼠肠道组织中,corin和ANP蛋白主要表达在单个细胞中,NPR-A主要表达在肠上皮吸收细胞。IF的结果显示,corin和ANP蛋白共定位于肠内分泌细胞,NPR-A蛋白主要表达在肠上皮吸收细胞膜表面。结论:本章节研究揭示了 corin、ANP和NPR-A蛋白在小鼠肠道的表达和细胞定位。提示corin和ANP可能在肠内分泌细胞中以自/旁分泌的机制调控corin-ANP信号通路,从而发挥生物学功能。第二章:Corin缺乏对小鼠结肠结构及肠道排钠功能的影响研究目的:在第一章中,研究发现corin、ANP和NPR-A蛋白均表达于小鼠肠道,而结肠的主要功能是吸收电解质和水分,形成、贮存和排泄粪便,那么在结肠中表达的corin和ANP是否通过调控粪便外排盐离子,从而发挥调节水盐平衡的功能?本章节旨在探究corin和ANP在结肠中的功能。同时,第一章中的结果提示corin和ANP在肠道可能发挥着独立于心源性和肾源性之外的调节功能,所以通过构建心脏特异性corin KO（Heart-conditional corin KO,hcKO）小鼠和肾脏特异性 corin KO（Kidney-conditional corin KO,kcKO）小鼠,检测心脏和肾脏中corin是否影响小鼠结肠corin在肠道发挥生理功能。研究方法:1.取10-12周龄SPF级的WT和corin KO雄鼠,利用H＆E染色的方法检测小鼠的结肠形态。给予小鼠0.3%或4%高盐饲料3周,收集粪便后烘干,统计小鼠排便量的差异,并检测粪便水溶液中Na+和Cl-浓度;2.取 10-12 周龄 SPF 级的心脏 corin cKO（hcKO）和肾脏 corin cKO（kcKO）雄鼠,给予0.3%或4%高盐饲料3周,收集粪便后烘干,检测粪便水溶液中Na+和Cl-浓度;3.据文献报道,醛固酮可增加ENaC活性,促进钠离子吸收。我们取10-12周龄SPF级的WT、corin KO和kcKO雄鼠,皮下埋入醛固酮渗透泵,收集粪便,检测WT、corin KO及kcKO小鼠在醛固酮给药前后经粪便的Na+和Cl-排泄情况。研究结果:1.H＆E染色显示,WT和corin KO小鼠的结肠结构和形态无明显差异;WT和corin KO小鼠的排便量也无显著差异（p=0.966）。提示corin缺失不影响小鼠的结肠组织形态和排便量;2.在正常盐饮食下,corin KO小鼠粪便中Na+和Cl-浓度显著低于WT小鼠（p＜0.001）。提示corin在小鼠体内发挥促进肠道钠Na+和Cl-外排的作用:3.高盐饮食组中,WT和corin KO小鼠粪便中Na+和Cl-浓度相较正常盐饮食均明显升高,且corin KO小鼠粪便中Na+和C1-浓度均显著低于同组WT小鼠（p＜0.001）。提示高盐饮食促进小鼠经肠道外排盐离子,且在高盐条件下corin促进Na+和Cl-外排作用更为显著;4.正常盐和高盐饮食下,hcKO小鼠粪便中Na+和Cl-浓度与WT小鼠相比均无明显差异,提示调控粪便中Na+和Cl-的corin蛋白不依赖于心脏corin的内分泌功能;5.正常盐和高盐饮食下,kcKO小鼠粪便中Na+和Cl-浓度显著性高于WT小鼠。提示:肾脏中corin蛋白缺失后,一部分本应由肾脏承担的排盐功能被结肠代偿发挥作用,从而经粪便排出更多盐离子;6.正常盐和高盐饮食下给予醛固酮,比较小鼠粪便中Na+和Cl-浓度。发现corin KO小鼠与给药前相比无显著差异;WT和kcKO小鼠与给药前相比粪便中Na+和Cl-浓度均下降;给药后WT、corin KO和kcKO小鼠粪便中原有的盐离子浓度差异消失。提示在小鼠肠道中,corin通过拮抗醛固酮促进肠道Na+和Cl-的外排。结论:Corin缺失不影响小鼠结肠的结构形态和排便量,但corin存在能促进经粪便Na+和Cl-的外排,高盐饮食下促Na+和Cl-外排的作用更为显著。WT和心脏corin cKO小鼠肠道外排盐离子水平无显著差异,提示不是心脏表达的corin通过内分泌作用来调控结肠中盐离子的外排;肾脏corin cKO小鼠肠道外排盐离子显著高于WT小鼠,提示肾脏中corin缺失后,结肠corin可以调控肠道外排更多盐离子,从而实现功能性代偿。外源性给予醛固酮后,WT和corin KO小鼠肠道排盐的差异消失,提示corin-ANP信号通路通过拮抗醛固酮发挥作用。综合第一章节研究结果,即corin、ANP和NPR-A均表达于结肠,提示肠道表达的corin通过自/旁分泌作用调控肠道盐离子外排,从而调控机体的水盐平衡。第三章:Corin缺乏对小鼠结肠炎疾病进展的影响研究目的:肠道内稳态的紊乱可以诱发多种肠道疾病,如炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）、感染性疾病、腹泻、结直肠癌等。有研究提示,肠道水和离子（尤其是Na+和Cl-）的吸收障碍是导致IBD相关性腹泻的主要原因之一。在前面章节中,我们发现corin、ANP和NPR-A均表达于小鼠结肠,并发挥促进肠道盐离子外排,从而调控机体水盐平衡的作用。那么,corin是否在IBD进程中也起到一定的调节作用呢?研究方法:1.取6-8周龄SPF级的WT小鼠和corin KO雄鼠,体重为25 g±1g,每种小鼠随机分配为两组,分别为Control组和DSS组。Control组小鼠自由摄取饮用水,DSS组小鼠自由饮用2.5%的DSS水溶液。每天记录体重,观察小鼠状态,8天后将小鼠处死;2.记录Control组和DSS组小鼠盲结肠长度,并拍照记录;取末端结肠（0.5-1公分,尽量选取相同部位）,一部分制作石蜡切片,后续用于观察组织形态,另一部分用以提取RNA,后续用于实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测;3.利用H＆E染色和Alcian blue染色的方法检测小鼠的结肠形态,并进行病理评分:利用免疫荧光染色的方法检测小鼠肠上皮细胞紧密连接结构;4.DSS组,记录造模后0、2、4、6和8天小鼠的体重、结肠长度以及结肠组织形态,监测小鼠动态病变变化;5.用qRT-PCR检测小鼠结肠中Tnf、Il-6、Il-10和Il-1β炎性因子的变化。研究结果:1.Control组中WT和corin KO小鼠体重保持稳定并缓慢增加状态,第6天起DSS-WT小鼠与对照WT小鼠相比,体重开始下降,而DSS-KO小鼠体重下降程度明显低于DSS-WT小鼠;2.Control组中,WT和corin KO小鼠结肠长度无统计学差异;DSS组,WT和corin KO小鼠结肠长度明显缩短,但DSS-KO小鼠结肠长度大于DSS-WT小鼠;3.H＆E、Alcian blue和免疫荧光染色显示,Control组中WT和corin KO小鼠在结肠形态上均完整,未见溃疡病变;DSS组小鼠结肠组织形态出现大面积溃疡和病变,但DSS-KO小鼠结肠病变程度低于比DSS-WT小鼠;4.H＆E染色展示了建模后第0、2、4、6、8天,DSS小鼠结肠组织从完整到病变溃烂的动态过程,DSS-WT小鼠结肠从第4天起出现明显病变,第8天上皮屏障完全受损并脱落,DSS-KO小鼠结肠病变程度相对较轻。结论:Corin缺失可以缓解DSS诱导结肠炎小鼠的严重程度,并减轻小鼠结肠炎的炎症反应。鉴于在上述章节中发现corin在肠道中的促排钠作用,我们推测corin缺失可能减轻了水钠经肠道丢失,调节肠道水钠平衡进而使小鼠结肠炎缓解,改善小鼠的健康状况。