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进行性近端型脊髓性肌肉萎缩症,简称脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是一组常见的常染色体隐性遗传病,其在活婴中的发病率约为1/10000,人群中携带者频率约为1/50。该病以脊髓前角运动神经元变性为特征,有时也可累及脑干运动神经元。临床上主要表现为下运动神经元性、进行性、对称性肌无力和萎缩,近端重于远端,下肢重于上肢。根据SMA发病年龄和病程的不同将其分为三型:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。该病的疾病基因为SMN1基因(survival motor neuron gene 1),定位于5号染色体长臂1区(5q11.2～13.3),于1995年被克隆,含9个外显子,编码一个由294个氨基酸残基组成、分子量为38kD的SMN蛋白。同时被克隆的还有该病的修饰基因SMN2。SMN1和SMN2高度同源:在编码区只有1个碱基的差别(位于第7外显子)。研究表明,在约95%的SMA患者存在SMN1基因第7外显子的纯合缺失,因此,利用PCR-RFLP法检测第7外显子纯合性缺失成为SMA临床分子诊断和产前分子诊断的首选。本研究的第一部分建立了两种比常规PCR-RFLP法更快速省时的缺失检测方法,即全血直接PCR-RFLP法和位点特异性PCR法,对14例SMA患者的SMN1基因第7外显子进行纯合性缺失检测,并将结果与常规PCR-RFLP法检测结果相比较。结果显示,全血直接PCR-RFLP法和位点特异性PCR法检测结果与常规PCR-RFLP法检测结果一致,证明这两种方法均是检测SMN1基因是否纯合缺失的快速而准确的新方法。本研究的第二部分对11个SMA家系的13个胎儿进行产前诊断,并提出了一套新的SMA产前分子诊断方案。这套方案为:超声监视下行羊膜穿刺术,抽取羊水30-40ml,离心收取羊水沉渣,直接从沉渣中提取胎儿基因组DNA和/或从培养后羊水细胞中提取胎儿基因组DNA;采用STR位点检测法排除母体基因组DNA污染;采用常规PCR-RFLP和位点特异性PCR两种方法检测胎儿SMN1基因第7外显子的缺失情况。结果显示,各胎儿均未见羊水DNA受母体DNA污染迹象。在常规PCR-RFLP中,胎儿A,C,D,E-2,F-1,F-2,I,J和K的PCR产物(189bp)仅有部分可被DraⅠ切割,而胎儿B,E-1,G和H的PCR产物全部被DraⅠ切割。在位点特异性PCR中,胎儿A,C,D,E-2,F-1,F-2,I,J和K既有SMN1、也有SMN2的第7外显子的扩增产物,而胎儿B,E-1,G和H只有SMN2第7外显子的扩增产物。以上结果说明,胎儿A,C,D,E-2,F-1,F-2,I,J和K不存在纯合性SMNl基因第7外显子缺失;其余胎儿(胎儿B,E-1,G和H)则存在纯合性SMN1基因第7外显子缺失。由于针对检测SMN1纯合缺失的PCR-RFLP法和位点特异性PCR法无法区分杂合性缺失患者、SMA携带者以及正常个体,故需引入定量技术对SMN基因拷贝数作定量分析。本研究的第三部分探讨多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术在SMA的分子诊断尤其是SMN基因拷贝数定量中的应用。从13例SMA患者、31名患者父母、10例胎儿羊水标本和50名正常人中提取基因组DNA,应用MLPA技术进行分析,同时也行常规PCR-RFLP和位点特异性PCR分析。MLPA对SMN1基因拷贝数的分析结果显示,13例患者均呈纯合缺失,与常规PCR-RFLP和位点特异性PCR结果一致;31名患者父母中除2名拷贝数为2外,其余29名均为1;50名正常人中除1名为1和1名为3外,其余48名均为2;10例胎儿中2例存在纯合缺失,与常规PCR-RFLP和位点特异性PCR结果一致,5例为1,3例为2;对于SMN2基因,13例患者中2例拷贝数为2,8例为3,3例为4;31名患者父母中5名为1拷贝,12名为2,14名为3;50名正常人中2名纯合缺失,6名为1,42名为2;10例胎儿中9例为2,1例为3。以上结果表明MLPA不仅能检测SMN1基因的纯合缺失,而且还能对SMN1和SMN2基因的拷贝数进行定量分析,是一种准确可靠的SMA分子诊断新方法。研究表明,在约5%的SMA患者中存在SMN1基因的点突变,因此,如果患者临床表现比较典型,但未能检出SMN1第7外显子的纯合缺失,应考虑其存在SMN1基因点突变的可能。本研究的第四部分对1例SMA患者及其家系成员的SMN1基因进行了点突变分析,并建立一套完整的SMN1点突变检测体系。这套体系采用MLPA技术、RT-PCR及T克隆-测序技术对患者SMN基因进行拷贝数分析和点突变的鉴定,应用MLPA和针对点突变区域(SMN基因组第5外显子)的PCR-直接测序法对患者父母SMN基因进行拷贝数分析和点突变的证实。结果显示,患者具有1个拷贝的SMN1基因和1个拷贝的SMN2基因,在这个SMN1基因第230位密码子上存在1个未见报道的错义突变S230L,即TCA→TTA;患者父亲具有2个SMN1和2个SMN2拷贝,其中一个SMN1基因存在S230L突变;患者母亲具有1个SMN1拷贝,而SMN2基因是纯合缺失的。在这部分研究中,我们发现了1个新的SMN1基因点突变,即S230L,并准确分析了此患者家系各成员的SMN基因型,为这个家系的遗传咨询提供了完整可靠的依据,并为未来的产前分子诊断工作打下了重要的基础。总之,本研究建立了一套完整SMA分子诊断体系,它包括SMA的临床快速分子诊断和产前分子诊断,又包括SMN基因的缺失检测、剂量分析以及点突变检测,这套广泛深入的SMA分子诊断体系为SMA家系提供了最为完整的遗传评估。