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第一部分miR-16在乳腺癌组织和细胞中的表达及意义目的:本课题组通过前期的工作,已经检测了不同miRNAs在乳腺癌阿霉素耐药细胞株和敏感株中的表达情况,发现miR-16在乳腺癌阿霉素耐药细胞株中呈现高表达。本研究拟在前期研究的基础上,进一步探讨miR-16在乳腺癌细胞系和组织中的表达水平,以及与乳腺癌患者临床病理学指标和预后的关系,分析miR-16表达的水平与乳腺癌阿霉素耐药是否存在相关性。方法:1、本实验的研究对象包括亲本乳腺癌细胞株（MCF-7/S）和其同系的阿霉素耐药细胞株（MCF-7/Adr）。通过采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测miR-16在这两种细胞株的表达水平。2、转染miR-16类似物（mimics）和其抑制物（inhibitors）于不同的细胞株,采用RT-qPCR法检测转染前后miR-16的表达;使用MTT法、流式分析细胞仪检测miR-16表达变化对乳腺癌细胞阿霉素耐药性的影响。3.本课题组在实验前已经收集了65例在2012年9月至2016年10月期间就诊于南京医科大学第一附属院接受阿霉素进行新辅助化疗的乳腺癌病例,接受治疗前均未行其他治疗。本研究已通过南京医科大学伦理委员会批准,所有入组的患者均签署知情同意书。对阿霉素的耐药性定义为对治疗无反应（稳定或进展）,或在停止治疗6个月内复发。我们挑选了有完整随访资料的共计40例乳腺癌（20例耐药,20例无耐药）参与研究,比较新辅助化疗后有效组与无效组中miR-16表达水平。通过RT-qPCR法检测上述乳腺癌患者肿瘤组织中miR-16的表达,了解miR-16与乳腺癌肿瘤组织耐药的相关性。进一步明确miR-16表达水平与乳腺癌患者临床病理学指标的是否存在相关性。4.分析miR-16表达水平与乳腺癌预后的关系。探究miR-16对于乳腺癌患者预后的预测价值。结果:1、RT-qPCR结果显示,相比于MCF-7/S,miR-16在MCF-7/Adr中低表达,验证结果与前期芯片结果一致。2、MCF-7/Adr在转染miR-16类似物后,与转染阴性对照相比,miR-16的表达明显升高,细胞IC50显著降低,而细胞凋亡增加;MCF-7/S转染miR-16 inhibitors后,miR-16的表达明显降低,细胞IC50显著升高,而细胞凋亡减少。3、检测接受新辅助化疗的乳腺癌患者肿瘤组织,相比于新辅助化疗有效组,miR-16在无效组中呈现低表达。miR-16的表达与肿瘤的大小以及TNM分期存在相关性4、随访数据证实,miR-16高表达组的患者,无病生存率明显高于miR-16低表达组。结论:miR-16在乳腺癌耐药株（MCF-7/Adr）中的表达明显低于其敏感株（MCF-7/S）,并在新辅助化疗后无效组乳腺癌患者组织中低表达。体外转染miR-16mimics和inhibitors后发现miR-16的表达水平与乳腺癌细胞对阿霉素（Adr）的耐药性呈负相关。miR-16与肿瘤大小以及TNM分期负相关,miR-16的低表达与乳腺癌患者的不良预后有关。因此miR-16有可能成为乳腺癌诊断和治疗的新靶点,可以作为预测乳腺癌患者的预后一个良好指标。第二部分miR-16对Wip-1/Bcl-2在乳腺癌阿霉素耐药中靶向调控目的:寻找并验证miR-16调控的靶基因及下游通路,进一步探讨miR-16对乳腺癌细胞阿霉素耐药的作用及其潜在的机制。方法:1、我们利用miRWalk软件预测多种可能存在的靶基因,并通过预实验和文献初步完成对靶基因的筛选工作;通过双荧光素酶报告实验验证miR-16的靶基因的分布及作用靶点,进一步寻找可能存在的结合位点;通过转染手段对乳腺癌细胞株中miR-16进行过表达和抑制,同时检测Wip-1/Bcl-2在基因和蛋白水平与miR-16的相关性。2、在乳腺癌组织和细胞株中,通过RT-qPCR的方法检测Wip-1/Bcl-2在基因水平的表达,通过免疫印迹法（Western blot）的方法检测Wip-1/Bcl-2在蛋白水平的表达。采用免疫荧光技术检测Wip-1/Bcl-2在细胞内的表达与分布。结果:miRWalk预测miR-16的靶基因并进行通路富集分析,发现miR-16富集于Wip-1/Bcl-2通路。miR-16通过靶向PPM1D和Bcl2的3’UTR抑制Wip-1/Bcl-2的表达。在miR-16存在的情况下,包含野生型PPM1D和Bcl-2 3’UTR的构建物的荧光素酶活性分别显著降低75%和55%。然而,当细胞转染突变型PPM1D和Bcl-2 3’UTR时活性没有差异,这表明PPM1D和Bcl-2基因是miR-16的直接靶点。在乳腺癌肿瘤组织及乳腺癌细胞中,在基因、蛋白表达层面,均显示低水平的miR-16表达与Wip-1/Bcl-2的高表达相关。western blotting和免疫荧光法检测Wip-1/Bcl-2在MCF-7/S和MCF-7/A细胞中的表达。结果显示,在MCF-7/A细胞中,Wip-1/Bcl-2的蛋白表达升高。结论:miR-16可以靶向调控Wip-1/Bcl-2在MCF-7/Adr和MCF-7/S细胞中的表达。可部分通过调节Wip-1/Bcl-2通路来影响乳腺癌阿霉素耐药,这可能是乳腺癌细胞对阿霉素耐药的一个重要的分子机制。