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红色荧光蛋白(RFP)是一种会发光的蛋白质,利用它可以观察到细胞的活动,进行深入的蛋白质研究等。红色荧光蛋白异源二聚体是由两个单体蛋白ddRFPA1和ddRFPB1聚合而成,二者化学性质差异明显。当它们处于单体状态时,ddRFPA1表现出微弱荧光,ddRFPB1无荧光,而结合时能形成明亮的红色二聚体,这源于两个单体之间建立了可自发介导荧光的蛋白质-蛋白质界面。如果在两个单体蛋白上引入N-糖基化的话,则能改变单体的界面,阻碍两者互相结合,使红色二聚体恢复单体状态,荧光明显减弱。PNGase是去N-糖基化最有效的酶之一,它可使两个ddRFP单体去糖基化,恢复蛋白质-蛋白质界面,形成荧光较强的二聚体状态。因此,通过RFP荧光强度的变化能对PNGase酶的活性进行检测。本文利用定点突变将N-糖基化位点引入ddRFP,突变体在大肠杆菌里(无糖基化系统)共表达后获得红色荧光二聚体;继而建立酵母表达系统(有糖基化系统)对该蛋白进行表达,获得糖基化蛋白产物;将目的蛋白做体外混合实验,通过测定混合物去糖基化后的荧光强度变化检测PNGase的活性,具体研究及结果如下:1.ddRFPA1、ddRFPB1的定点突变和突变体共表达根据ddRFPA1、ddRFPB1的基因序列设计含有突变位点的引物,突变位点分别为 Lys139A、Tyr146A、Phe178A、Va1196A、Glu160B、Va1196B 突变为 Asn,Va1176A、Glu1O1B 突变为 Ser。结果成功获得 RFP139A、RFP146A、RFP176A、RFP178A、RFP196A、RFP196B 突变体,RFP101B、RFP160B 突变失败。将野生型ddRFPA1和突变型A(所有ddRFPA1的突变体)分别转化至含有ddRFPB1、RFP196B基因的BL21感受态细胞中,表达结果显示:在BL21细胞中形成了ddRFPA1/ddRFPB1、ddRFPA1/RFP196B、RFP139A/RFP196B 共 3 个二聚体,且这 3个二聚体都能发出明亮的红色荧光,与对照组单个ddRFPA1、ddRFPB1、RFP196B存在明显差异。2.ddRFPA1、ddRFPB1及突变体的真核亚克隆与酵母表达ddRFPA1、ddRFPB1及其突变体经引物设计、PCR扩增、连接到中间载体、酶切后连接至真核载体pPICZαB-H,以5AOX作为引物测序,所有基因均克隆成功。用醋酸锂法制备GS115酵母感受态细胞,将荧光蛋白基因与pPICZαB-H载体的重组质粒通过MSSI酶切线性化,后转化至酵母细胞获得成功转化子,转化子经扩大培养和表达培养一周后得到目的蛋白表达上清,预处理后经western blot验证,结果显示:ddRFPA1和ddRFPB1及其突变体能在酵母系统内成功表达,其表达蛋白与目的蛋白条带38kDa大小一致。3.红色荧光二聚体在PNGase活性检测中的应用将第二章酵母表达上清预处理后,在96孔酶标板中分别将ddRFPA1和RFP196B 各 100 ul 按 1:1 混合,将 RFP139A 和 RFP196B 各 100 ul 按 1:1 混合,加入PNGase酶,在荧光酶标仪内37℃孵育16 h,每2 h测定其荧光值(ex/em:535 nm/605 nm)。结果表明:二聚体ddRFPA1/RFP196B在PNGase的作用下荧光值呈显著性升高,与空白对照组差异明显。而组合RFP139A/RFP196B的荧光值无显著性变化。本文为荧光蛋白二聚体的研究提供了结构性的假设,验证表明蛋白糖基化对二聚体的结构能产生影响,从而影响其荧光强度,这为荧光蛋白的研究提供了新的方向,PNGase的活性检测一般使用化学方法,用PNGase酶解底物后,用荧光团2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记释放的N-聚糖并使用高效液相色谱(HPLC-FD)检测切掉的糖链,本文是一种通过荧光酶标仪来间接检测PNGase酶活的方法,提高了PNGase酶活性检测的安全性、方便性和快捷性。