马铃薯早疫病生防菌株的分离筛选及效果研究

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由于多年连作重茬不合理的种植模式,马铃薯早疫病害在世界各主产区频发。本研究在山东省临沂市马铃薯种植基地发现早疫病病株,此病害在马铃薯生长中后期导致叶片过早干枯,造成薯块产量严重下降。通过采集马铃薯早疫病发病植株,采用组织分离法对其发病叶片的病原菌进行分离培养,并经菌种纯化、致病性检测、病原菌鉴定及生物学特性等研究,旨在分析确定病原菌的分类地位,掌握该病的发病规律,以便为链格孢菌属引起的马铃薯早疫病的生物防治提供理论依据;以马铃薯早疫病原菌为靶标菌株,通过室内平板对峙试验初步筛选出其生防菌株,依据形态学观察、生理生化检测以及分子生物学鉴定,确定生防菌株的种属分类地位,对筛选的生防菌株的生物学特性和防病促生基因进行检测,并进一步布置盆栽与大田实验对其进行防治效果验证。主要研究结果如下:1)采集马铃薯早疫病病株,采用组织分离法获得病原菌ZH-Z01菌株,纯化培养后进行形态特征观察,结合ITS序列比对,确定病原菌ZH-Z01的种属。结果表明:病原菌ZH-Z01菌落呈墨绿色,菌丝为灰白色,有黑褐色色素产生;分生孢子倒梨形、淡黄色、喙短小,分生孢子的大小为17.5~37.5μm×7~10.5μm,具隔膜1~4个,横膈膜数多于纵隔膜数;分生孢子梗单生或簇生,具隔膜,大小为12~30μm×8~20μm。菌株ZH-Z01测序结果显示该菌的ITS1-ITS4序列长度为567 bp,与不同来源的链格孢菌(Alternaria alternata)的相似度≥99%以上。结合形态学观察和分子生物学鉴定将ZH-Z01鉴定为链格孢菌(A.alternata)。经最适培养条件试验,链格孢菌ZH-Z01菌的最适培养温度为30℃,最适p H为6.0,最适宜的碳源、氮源分别为麦芽糖和蛋白胨;24 h全黑暗条件下,菌落扩展得最快;紫外线照射20 min有助于病原菌的生长;在燕麦培养基上生长最快。2)以链格孢菌ZH-Z01为靶标病原菌,采用平板对峙法筛选出对其抑制作用强的菌株。最终确定3株平均抑菌率≥80%的生防菌株,对抑菌圈边缘菌丝进行显微形态观察,发现病原菌菌丝弯曲、畸形及生长停滞等现象。依据形态观察、生理生化特性测定及分子生物学鉴定,将这3株生防菌株分别鉴定为贝莱斯芽孢杆菌WB-1(Bacillus velezensis)、贝莱斯芽孢杆菌WB-2(Bacillus velezensis)、枯草芽孢杆菌WK-1(Bacillus subtilis)。三株菌株对四环素、多粘菌素B、氯霉素及链霉素等多种抗生素具有较强抗性;菌株WB-1、WB-2、WK-1的最适碳源分别为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉;三株菌株最适氮源为蛋白胨;培养条件为:最佳温度30℃、适宜初始p H为4.0~8.0。此外,三株生防菌株之间无相互抑制作用。三株菌株的抑菌效果具有广谱性,对水稻恶苗病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、马铃薯黑痣病菌、玉米大斑病菌及花生白绢病菌6种植物病原真菌均具有一定的抑制作用。同时,生防菌株WB-1、WB-2可扩增到抗菌脂肽类合成基因fen D(293 bp)、itu C(575 bp)、srf AA(273 bp)、srf AB(308 bp)的特征片段;三株生防菌株均可扩增到促生类合成基因phy(632 bp)、ysn E(504 bp)的特征片段,生防菌株WB-1和WK-1可扩增到固氮合成基因nif H(610 bp)的特征片段。此结果说明该菌株具备防病及促生的潜能。3)盆栽验证结果表明,复合菌的防病效果优于单一菌株,相对于对照组,经生防菌剂处理,马铃薯早疫病的病情指数均有所降低,相对防效均有所增加。此外,施用生防菌株WK-1的处理,土壤中细菌物种Ace指数、Chao指数和Shannon数值均有提高,且Simpson指数降低;真菌微生物种群的相应指数则呈相反变化。此结果表明生防菌剂WK-1的使用可提升土壤有益细菌菌群丰度和微生物群落多样性,对土壤真菌的增殖起到抑制作用。大田验证结果:相比于空白对照组及市场菌剂处理,经最佳复配菌剂组合(WB-2+LJ+45#)处理,病情指数分别降低了53.33、19.44;相对防效分别提高了76.19%、28.08%;生长指标中,株高和分支数均有所增加;产量分别增长了34.7%、27.3%;可溶性淀粉含量分别增加了3.16%、2.85%,可溶性糖分别含量提高了0.33%、0.24%,蛋白含量分别增加了1.31%、0.57%,Vc含量分别增加了1.04 mg/100g、1.05 mg/100g。
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