环境内分泌干扰物的污染及其对人类生殖系统的损害，已经成为当今环境卫生学领域关注的热点。DEHP作为一种环境内分泌干扰物在环境中广泛存在，我国虽已将其列入优先监测环境污染物，但近年来的白酒塑化剂事件、聚氯乙烯保鲜膜和出口玩具DEHP超标等一系列事件提示我国增塑剂污染问题严重，已引起学者的广泛关注。目的：从组织、细胞和分子水平系统的探讨DEHP及MEHP对性激素分泌水平和颗粒细胞凋亡的作用机制，阐明DEHP和MEHP对雌性生殖器官和生殖功能的影响，以探讨DEHP的生殖内分泌干扰作用，为明确DEHP与雌性生殖内分泌毒性的关系提供理论基础，为全面评价DEHP的毒理学作用及其对人类生殖系统潜在危害提供科学依据。100LD₅₀方法：第一部分DEHP和MEHP的一般生殖毒性研究1.体内实验：将48只成年雌性Wistar大鼠随机排序分组法分为4个剂量组，即阴性对照组（玉米油）、低剂量组（300mg/kg/d，1/）、中剂量组(1000mg/kg/d，1/30LD₅₀)、高剂量组(3000mg/kg/d，1/10LD₅₀)，每组12只。每天灌胃1次，每周连续6天，共4周。观察大鼠的一般生长状况，记录饮水量、摄食量及体重变化情况；处死前两周，每天早6时和晚6时采用阴道脱落细胞涂片法观察动情周期变化，研究DEHP对动情周期的影响；于动情间期处死大鼠，大鼠眶内取血，取子宫、卵巢组织，计算卵巢、子宫的脏器系数；HE染色法观察大鼠卵巢、子宫病理组织变化；放射免疫分析法测定血清中FSH、LH等激素水平；免疫组织化学染色法测定卵巢、子宫组织FSH、LH激素受体表达情况。2.体外实验：取21～29d龄未成年雌性Wistar大鼠卵巢颗粒细胞进行原代培养，采用HE染色和免疫细胞化学染色法对所获取的细胞进行鉴定，观察细胞的一般生长状况及性激素分泌情况，并采用MTT法测定生长曲线，放射免疫法测定培养基中P4和E2激素分泌水平。以DEHP主要代谢产物MEHP对颗粒细胞进行染毒，染毒剂量分别为0（对照组）、25、50、100μmol/L。染毒结束后MTT法检测细胞相对活力，放射免疫法测定培养基中P4和E2激素分泌水平，免疫细胞化学染色法检测卵巢颗粒细胞FSH受体表达情况。第二部分DEHP和MEHP对性激素合成通路基因及其受体表达的影响和机制1.体内实验：动物分组及染毒同第一部分，提取卵巢组织RNA，运用RT-PCR法检测大鼠卵巢性激素合成通路STAR、P₄₅₀scc、3β-HSD、17β-HSD Ι、17β-HSDII和P450arom基因表达差异，采用免疫组织化学法观察卵巢、子宫组织性激素受体PR、ER的表达量。2.体外实验：卵巢颗粒细胞原代培养、鉴定方法及染毒同第一部分。运用RT-PCR法检测体外卵巢颗粒细胞性激素合成通路STAR、P450scc、3β-HSD、17β-HSD Ι、17β-HSD II和P₄₅₀arom基因表达差异，采用免疫细胞化学染色法观察颗粒细胞性激素受体PR、ER的表达量。第三部分DEHP和MEHP对卵巢颗粒细胞凋亡的影响及其机制1.体内实验：动物分组及染毒同第一部分，分离卵巢颗粒细胞，采用AnnexinV-FITC/PI双染法观察DEHP诱导大鼠卵巢颗粒细胞凋亡情况，利用分光光度法检测Caspase-3活性，Western Blot法测定凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达水平。2.体外实验：卵巢颗粒细胞原代培养、鉴定方法及染毒同第一部分。采用Annexin V-FITC/PI双染法观察MEHP诱导体外卵巢颗粒细胞凋亡情况，利用分光光度法检测颗粒细胞Caspase-3活性，Western Blot法测定颗粒细胞凋亡相关蛋白Bax，Bcl-2表达水平。结果：第一部分DEHP和MEHP的一般生殖毒性研究1．经DEHP灌胃染毒，染毒组雌性大鼠动情后期、动情间期及动情周期持续时间与对照组比较明显延长（P＜0.05）；各染毒组大鼠动情前期和动情期持续时间与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。2．各染毒组大鼠饮水量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而DEHP染毒组大鼠摄食量与对照组比较逐渐增加（P＜0.05），但是染毒组大鼠体重与对照组比较明显下降（P＜0.05）。3．DEHP染毒组大鼠卵巢脏器系数与对照组比较明显降低（P＜0.05），而各染毒组大鼠子宫脏器系数与对照组比较无明显差异（P＞0.05）。对照组大鼠卵巢组织结构完整，可见处于不同阶段的卵泡，黄体、白体及卵巢间质形态正常。DEHP染毒组大鼠卵巢卵泡内颗粒细胞存在不同程度的损伤现象，出现弥漫性颗粒细胞结构疏松、水肿、核固缩、核碎裂等病理变化；颗粒细胞与膜细胞间隙增宽；闭锁卵泡明显增多。对照组大鼠子宫组织结构未见异常，而染毒组大鼠子宫内膜出现胞核假复层现象，上皮增生和内皮纤维化，腔上皮细胞排列不整齐、疏松，细胞核大小不均；固有层腺体数目减少，部分腺体萎缩。4．DEHP暴露大鼠血清FSH、LH、P4、T和E2激素分泌水平与对照组比较明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。5.与对照组比较，DEHP染毒组大鼠卵巢和子宫组织中免疫组织化学染色程度减弱，面积减小。半定量分析显示，各染毒组大鼠子宫组织中LHR表达水平较对照组明显降低（P＜0.05）；其他受体表达水平随剂量增加呈下降趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。6.随着MEHP染毒剂量增加，颗粒细胞的相对活力逐渐下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。7.随着MEHP染毒剂量增加，细胞培养液中的P4与E2激素分泌水平随之增加，呈明显的剂量-效应关系，差异具有统计学意义（P＜0.05）。8.与对照组比较，MEHP染毒组卵巢颗粒细胞中免疫组织化学染色程度增强，面积增加。半定量分析显示，各染毒组卵巢颗粒细胞FSHR表达水平与对照组比较明显增加（P＜0.05）。第二部分DEHP和MEHP对性激素合成通路基因及其受体表达的影响和机制1.各染毒组大鼠卵巢性激素合成通路STAR、P450scc、3β-HSD、17β-HSD Ι、17β-HSD II和P450arom基因相对表达水平与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），且随DEHP染毒剂量增加而明显下降，呈明显的剂量-效应关系。2.与对照组比较，DEHP染毒组大鼠卵巢和子宫组织中PR、ER免疫组织化学染色程度减弱，面积减小。半定量分析显示，卵巢组织中PR、ER表达水平随DEHP染毒剂量增加而明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），而各染毒组子宫组织PR、ER表达水平与对照组比较无明显差异（P＞0.05）。3. MEHP体外染毒卵巢颗粒细胞，性激素合成通路STAR、P₄₅₀scc、17β-HSDΙ及17β-HSD II基因相对表达水平与对照组比较明显增加（P＜0.05），而各组3β-HSD、P₄₅₀arom基因相对表达水平无明显差异（P＞0.05）。4. MEHP染毒组卵巢颗粒细胞PR、ER免疫组织化学染色程度增强，面积增加。半定量分析显示，卵巢颗粒细胞PR、ER表达水平与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），并且随MEHP染毒剂量增加明显增高。第三部分DEHP和MEHP对卵巢颗粒细胞凋亡的影响及其机制1. DEHP能够使大鼠卵巢颗粒细胞早期、晚期及总凋亡率明显增加（P＜0.05），Bax/Bcl-2蛋白比例是决定细胞凋亡的关键因素，随着DEHP染毒剂量的增加，Bax/Bcl-2逐渐升高，并呈现明显的剂量-效应关系（P＜0.05）；而各组大鼠卵巢颗粒细胞Caspase-3活性差异无统计学意义（P＞0.05）。2. MEHP能够使大鼠体外卵巢颗粒细胞早期、晚期及总凋亡率明显增加（P＜0.05），随着MEHP染毒剂量的增加，Bax/Bcl-2逐渐升高，并呈现明显的剂量-效应关系（P＜0.05）；各染毒组大鼠卵巢颗粒细胞Caspase-3活性与对照组比较明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：1．DEHP暴露能够引起雌性大鼠动情后期、动情间期持续时间明显延长，进而导致动情周期时间明显延长；DEHP染毒能够使雌性大鼠卵巢脏器系数降低，引起卵巢卵泡内颗粒细胞不同程度损伤，提示卵巢可能是DEHP雌性生殖毒性作用的主要靶器官。2.成功建立大鼠卵巢颗粒细胞体外培养体系，MEHP染毒能够降低卵巢颗粒细胞相对活力，抑制颗粒细胞增殖。3. DEHP暴露能够降低大鼠卵巢性激素合成通路STAR、P₄₅₀scc、3β-HSD、17β-HSD Ι、17β-HSD II和P₄₅₀arom基因和性激素受体表达水平，抑制FSH、LH、P4、T和E2激素分泌，提示DEHP可能通过影响卵巢性激素合成通路相关基因和性激素受体表达，干扰卵巢生殖内分泌功能。4. MEHP体外染毒能够增加卵巢颗粒细胞性激素合成通路STAR、P₄₅₀scc、17β-HSD Ι及17β-HSD II基因和性激素受体表达水平，刺激颗粒细胞P₄与E₂激素分泌，干扰体外颗粒细胞正常的分泌功能。5.体内DEHP暴露和体外MEHP染毒均能够增加大鼠卵巢颗粒细胞早期、晚期及总凋亡率，增高Bax/Bcl-2比值，激活颗粒细胞内Caspase-3，提示DEHP和MEHP可能通过线粒体途径诱导卵巢颗粒细胞凋亡。总之，DEHP及其代谢产物MEHP能够对雌性大鼠生殖器官和生殖内分泌功能产生影响，诱导卵巢颗粒细胞发生凋亡，具有一定的雌性生殖毒性，对生物具有一定的生殖内分泌干扰作用。