【背景和目的】肿瘤细胞的凋亡主要由死亡受体途径(外源性)和/或线粒体途径(内源性)介导。来自死亡受体的信号能够通过Bcl-2家族而与线粒体途径交联,进而造成细胞色素C的释放,并启动凋亡体信号放大系统,因此在这一过程中’Bcl-2家族处于非常关键的地位,其成员蛋白表达的失衡将导致凋亡信号通路的障碍,比如高表达抗凋亡蛋白Bcl-XL将导致多药耐药的细胞表型,而增加促凋亡蛋白Bax的表达则能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡。目前越来越多的证据表明,Bcl-2家族中抗调亡蛋白/促凋亡蛋白的值可能是一个提示肿瘤细胞是否抵抗凋亡的良好指标。在结肠癌中BcI-XL是Bcl-2家族中表达最高的抗凋亡蛋白。最近我们利用RNA干扰技术,应用人工合成的siRNA下调Bcl-XL蛋白表达后,有效地诱导了获得性5-Fu耐药的结肠癌细胞发生凋亡,而且进一步的实验发现它还能够逆转结肠癌细胞对TRAll基因的耐药,这些结果初步提示针对Bcl-XL的RNA干扰在结肠癌治疗中可能存在着较高的应用价值。但是在实际操作中RNA干扰作为一种生物治疗手段,它的治疗效果直接受到siRNA在体内的稳定性、siRNA转导的组织特异性以及siRNA在肿瘤细胞中转导效率的影响。近年来随着研究地深入,人们发现运用DNA质粒转导shRNA能增加siRNA的稳定性,但是在DNA质粒应用过程中仍存在转染效率低下的问题。因此迫切需要一种更加有效的方法来体内转导siRNA。先前的经验告诉我们腺病毒能够在肿瘤细胞中高效地转导目的基因,因此我们拟在本研究中选用重组腺病毒作为运送载体来转导Bcl-XL shRNA以期达到杀灭结肠癌细胞的目的。【方法】:首先构建、重组和纯化腺病毒Ad/Bcl-XL shRNA,然后通过RT—PCR、MTT分析、细胞克隆形成实验、Western blot免疫印迹以及动物实验等方法来验证Ad/Bcl-XL shRNA对Bcl-XL的下调作用及其在体内外的抗肿瘤效果。【结果】:我们成功构建和纯化了重组腺病毒Ad/Bcl-XL shRNA。实验结果显示500MOI的Ad/Bcl-XL shRNA即能在mRNA水平和蛋白水平显著下调Bcl—XL的表达。接着我们发现感染72h后Ad/Bcl-XL shRNA明显抑制了人结肠癌DLD1和Lovo细胞的生长(p＜0.05),该抑制作用具有剂量和时间依赖关系,而对照载体Ad/GFP则对结肠癌细胞的生长无明显影响。细胞克隆形成实验的结果显示Ad/Bcl-XL shRNA作用14天后明显抑制了DLD1细胞的克隆形成(p＜0.05),该抑制作用同样也具有剂量依赖关系。接着Western blot免疫印迹结果显示Ad/Bcl-XL shRNA能有效激活结肠癌细胞中的凋亡信号分子,包括caspase-9、caspase-3和PARP。同时我们也发现Ad/Bcl-XL shRNA对NHFB无明显毒性作用,这可能与NHFB中Bcl-XL表达低下有关。进一步的实验显示Ad/Bcl-XL shRNA能有效抑制DLD1细胞来源的裸鼠皮下肿瘤的生长,并且反复多次瘤内注射Ad/Bcl-XL shRNA不会造成重要脏器的明显病理学损害。最后我们通过22例结肠癌患者手术标本的直接接种,成功建立起3例结肠癌临床标本来源的原代肿瘤动物模型,模型构建的成功率为13.6%。Ad/Bcl-XLshRNA在这3例原代肿瘤模型中均能显著抑制原代肿瘤的生长,并明显延长荷瘤裸鼠的生存时间(p＜0.05)。【结论】:1)成功构建和纯化了重组腺病毒Ad/Bcl-XL shRNA;2)证实Ad/Bcl-XL shRNA能有效地下调结肠癌细胞中Bcl-XL的表达,包括mRNA水平和蛋白水平;3)Ad/Bcl-XL shRNA能明显激活凋亡信号途径,有效杀伤结肠癌细胞;4)成功建立起结肠癌临床标本来源的裸鼠原代肿瘤模型;5)Ad/Bcl-XL shRNA在动物模型中显著抑制了结肠肿瘤的生长,包括细胞系来源的肿瘤和临床标本来源的原代肿瘤。