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研究背景与目的:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜增生为特征的慢性自身免疫性疾病。病理特征为炎症细胞浸润、滑膜组织增生以及血管翳的形成,进而导致软骨及骨质破坏,最终导致关节功能障碍。RA成纤维样滑膜细胞(Rheumatoid arthritis Fibroblast-like synoviocyte,RA-FLS)是滑膜组织的主要成分,在炎性因子的刺激下,RA-FLS异常活化,具有异常的迁移、侵袭等一些类似于肿瘤细胞样的特性。在关节软骨和骨侵蚀中发挥关键作用。基质金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases,TIMPs)是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的天然抑制剂。TIMP3是TIMPs家族中唯一几乎能抑制全部MMPs的抑制剂。小分子非编码RNA已成为包括自身免疫性疾病在内的多种疾病的可能生物标志物,参与细胞增殖、凋亡、分化、血管生成和免疫应答等过程的调控。miR-206属于MyomiRs家族,近年来研究表明,miR-206能调控肿瘤细胞的迁移与侵袭。我们课题组前期发现RA-FLS的迁移与侵袭能力较正常FLS强,通过基因芯片检测以及RT-qPCR实验证实RA-FLS中miR-206明显高于正常FLS,而TIMP3的明显低于正常FLS。本实验通过研究miR-206对RA-FLS迁移及侵袭的影响,验证miR-206能否通过靶向调控TIMP3影响RA-FLS迁移及侵袭,本研究结果可以进一步完善我们对RA患者软骨和骨侵蚀及破坏机制的理解,有可能为RA的治疗提供新的思路。方法:以人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞株(MH7A)以及RA患者的滑膜组织培养出的原代成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)作为研究对象。1、培养MH7A细胞株以及原代RA-FLS,用FIIC标记的鼠抗人CD90抗体及PE标记的鼠抗人CD55抗体对细胞进行标记,采用流式细胞仪进行细胞鉴定。2、应用表达TIMP3的腺病毒(ad-TIMP3)感染RA-FLS,通过RT-qPCR实验对RA-FLS中TIMP3的mRNA水平进行检测;通过Westem Blot实验对RA-FLS中TIMP3的蛋白水平进行检测;证实TIMP3在RA-FLS中过表达后进行后续研究。通过细胞划痕实验研究过表达TIMP3在二维层面对RA-FLS迁移的影响;通过Transwell细胞迁移实验研究过表达TIMP3在三维层面对RA-FLS迁移的影响;通过Transwell细胞侵袭实验研究过表达TIMP3对RA-FLS侵袭的影响。3、应用表达miR-206的腺病毒感染RA-FLS,采用RT-qPCR方法证实miR-206在RA-FLS过表达后进行下一步研究。包装抑制表达miR-206的慢病毒并感染RA-FLS(MH7A)细胞,采用RT-qPCR方法证实miR-206在RA-FLS(MH7A)中表达被抑制后,可进行后续研究。通过细胞划痕实验分别研究过表达miR-206及抑制miR-206表达在二维层面对RA-FLS迁移的影响;通过Transwell细胞迁移实验分别研究过表达miR-206及抑制miR-206表达在三维层面对RA-FLS迁移的影响;通过Transwell细胞侵袭实验分别研究过表达miR-206及抑制miR-206表达对RA-FLS侵袭的影响。4、通过RT-qPCR实验对过表达miR-206的RA-FLS中TIMP3的mRNA水平进行检测;通过Western Blot实验对过表达miR-206的RA-FLS中TIMP3的蛋白水平进行检测;通过RT-qPCR实验对抑制miR-206表达的RA-FLS中TIMP3的mRNA水平进行检测;通过Western Blot实验对抑制miR-206表达的RA-FLS中TIMP3的蛋白水平进行检测。5、通过PCR扩增RA-FLS中可能与miR-206靶向结合的TIMP3的3’UTR片段并将其克隆至psiCHECK-2载体上,构建出野生型双荧光素酶报告基因载体(psiCHECK-2-TIMP3-3’UTR-WT);同时,本研究使用 Fast Site-Directed Mutagenesis Kit(天根生化科技有限公司,KM101)试剂盒构建了序列突变型的双荧光素酶报告基因载体(psiCHECK-2-TIMP3-3’UTR-mut)。分别在过表达 miR-206 的细胞、抑制 miR-206 表达的细胞、以及空白对照(NC组)细胞中转染psiCHECK-2-TIMP3-3’UTR-WT或者psiCHECK-2-TIMP3-3’UTR-mut载体,采用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测报告基因(萤火虫荧光及海肾荧光)的表达情况,分析miR-206与TIMP3能否靶向结合。研究结果:1、流式细胞仪检测结果显示,MH7A中表达CD55+/CD90+的细胞百分比为95.27±1.34%(n=4),取自RA患者滑膜组织培养出的原代RA-FLS表达CD55+/CD90+的细胞百分比为97.82±1.26%(n=4),该结果表明这两种细胞均为RA-FLS,可用于后续研究。2、RT-qPCR检测结果显示,感染表达TIMP3的腺病毒的RA-FLS中TIMP3的mRNA水平上调,Western Blot检测结果显示,感染过表达TIMP3腺病毒的RA-FLS中TIMP3的蛋白水平上调,表明TIMP3过表达的RA-FLS模型构建成功。细胞划痕实验结果显示过表达TIMP3能在二维层面抑制RA-FLS的迁移;Transwell迁移实验及Transwell侵袭实验结果显示过表达TIMP3可以明显抑制RA-FLS的迁移与侵袭。3、RT-qPCR实验结果表明,表达miR-206的腺病毒感染RA-FLS后,RA-FLS中miR-206表达上调,证实了过表达miR-206的RA-FLS模型构建成功。细胞划痕实验结果显示过表达miR-206能在二维层面促进RA-FLS的迁移;Transwell迁移和侵袭实验结果显示过表达miR-206可以明显促进RA-FLS的迁移与侵袭。4、RT-qPCR实验结果表明,感染表达miR-206抑制物慢病毒的RA-FLS中miR-206表达下调,证实了抑制miR-206表达的RA-FLS模型构建成功。细胞划痕实验结果显示抑制miR-206表达能在二维层面抑制RA-FLS的迁移;Transwell迁移和侵袭实验结果显示抑制miR-206表达可以抑制RA-FLS的迁移与侵袭。5、RT-qPCR结果表明,过表达miR-206的RA-FLS中TIMP3的mRNA水平下调,而抑制miR-206表达的RA-FLS中TIMP3的mRNA水平上调;同时,Western Blot检测结果表明,过表达miR-206的RA-FLS中TIMP3的蛋白的表达水平下调,抑制miR-206表达的RA-FLS中TIMP3的蛋白的表达上调。这些结果表明在RA-FLS中miR-206与TIMP3存在负调控关系。6、DNA 测序结果表明,psiCHECK-2-TIMP3-3’UTR-WT 重组载体及psiCHECK-2-TIMP3-3’UTR-mut重组载体均构建成功。双荧光素酶报告基因实验结果显示转染psiCHECK-2-TIMP3-3’UTR-WT的过表达miR-206的细胞中的海肾荧光值/萤火虫荧光值的相对比值较NC组细胞明显下降,而转染psiCHECK-2-TIMP3-3’UTR-mut载体的过表达miR-206的细胞的海肾荧光值/萤火虫荧光值的相对比值与NC组细胞相比无明显变化;转染psiCHECK-2-TIMP3-3’UTR-WT重组载体的抑制miR-206表达的细胞的海肾荧光值/萤火虫荧光值的相对比值较NC组细胞明显上调,而转染psiCHECK-2-TIMP3-3’UTR-mut载体的抑制miR-206表达的细胞的海肾荧光值/萤火虫荧光值的相对比值与NC组细胞相比无明显变化;这与我们前面的RT-qPCR及Western blot实验结果一致,证实TIMP3是miR-206的靶基因。结论:1、miR-206可以促进RA-FLS的迁移与侵袭。2、miR-206可以通过靶向调控TIMP3的表达,影响RA-FLS迁移及侵袭。