丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是一种传统的药用草本植物,被广泛用于治疗脑血管疾病、冠心病、炎症和心绞痛等多种疾病。酚酸类化合物和丹参酮类化合物是丹参两类主要代谢物。丹参作为药用模式植物之一,备受研究者的关注。由于丹参体内药用活性成分积累较少,因此利用基因工程技术提高丹参中药用活性成分的含量具有重要意义。LBD（Lateral Organ Boundaries Domain）是植物特有转录因子之一,参与植物中多个生长发育过程。近年来,多篇研究聚焦在LBD基因家族ClassⅡ类转录因子参与调控的植物次生代谢产物的积累方向,例如影响拟南芥和苹果中的花青素以及丹参中酚酸类物质的合成。此外,LBD转录因子在茉莉酸（JA）信号转导通路中亦发挥着重要作用。然而,LBD基因在调控丹参中次生代谢产物含量的积累及参与JA信号通路的具体分子机制还未被完全解析。本论文以丹参LBD基因家族Class Ⅱ类成员SmLBD44基因为研究对象,重点研究了SmLBD44转基因株系次生代谢产物含量的变化,并对该基因的功能进行了初步探索。本研究的主要内容及结果如下:1.基于丹参转录组及基因组数据库,PCR克隆得到SmLBD44基因,该基因全长768 bp,CDS长度为687 bp,编码228个氨基酸残基,蛋白相对分子质量大小为24.8 kDa。序列分析结果显示SmLBD44蛋白具有典型的LOB结构域,属于LBD家族。聚类分析表明SmLBD44与拟南芥Ⅱ类LBD蛋白聚集且具有较高的同源性。SmLBD44蛋白为亲水性蛋白,不具有跨膜结构,也不存在信号肽,亚细胞定位表明该蛋白作为转录因子在细胞核中表达。同时,该基因的表达量受到外源性茉莉酸甲酯（MeJA）的显著诱导,推测SmLBD44可能参与了 JA信号转导途径。2.通过Gateway技术构建了SnLBD44的过表达和干涉载体并获得了SmLBD44转基因株系。经过DNA和RNA分子水平验证后,分别选取过表达株系OE44-2、OE44-5 和 OE44-10 与干涉株系 ir44-5、ir44-6 和 ir44-7 用于后续研究。3.选择野生型株系作为对照,对SmLBD44过表达和RNAi植株中苯丙烷代谢下游次生代谢物含量进行系统考察,OE44-2、OE44-5和OE44-10中总酚酸含量分别是对照的55%、52%和84%,总黄酮含量分别是对照的47%、54%和62%;干涉株系ir44-5、ir44-6和ir44-7的总酚酸含量分别是对照的1.42倍、1.28倍和1.51倍,总黄酮含量分别是对照的1.67倍、1.78倍和1.44倍;而花青素的含量在转基因株系中与对照株系中无显著差别。结果提示SmLBD44对丹参中总酚酸和总黄酮的积累起到抑制作用。4.利用LC/MS法对SmLBD44转基因株系中3种丹参酮和3种酚酸的含量进行测定,结果显示SmLBD44基因的表达对丹参酮物质的积累起抑制作用,相比之下对酚酸类物质含量的积累无显著影响。这些结果表明SmLBD44在丹参酮类物质的生物合成中可能起到负调控作用。5.对SmLBD44转基因株系中次生代谢产物合成通路上的关键酶基因的表达量进行检测,结果表明在SmLBD44过表达株系中,丹参酮合成途径上的8个酶基因（SmDXS1、SmHMGR1、SmFPPS、SmGPPS、SmGGPPS、SmCPS1、SmKSL1、SmCYP76AH1）和丹酚酸合成途径上的7个酶基因（SnPAL1、SmC4H1、Sm4CL1、SmTAT1、SmHPPR、SmRAS、SmCYP98A14）相比对照均显著下调,而在SmLBD44干涉株系中,除SmGPPS和SmRAS与对照无显著差异外,其他酶基因均显著上调。表明SmLBD44通过抑制合成通路上多个酶基因的表达量抑制丹参酮及丹酚酸类物质的积累。6.双分子荧光互补实验显示SmLBD44蛋白可以与SmJAZ1发生互作,提示SmLBD44可能参与了茉莉酸（JA）信号通路。酵母单杂交实验和瞬时转录激活实验结果初步确定了 SmLBD44可直接与丹参酮合成通路上的酶基因SmKSL1结合并抑制其转录活性。此外,SmJAZ1单独存在时不影响SmKSL1的启动子活性,但与SmLBD44共同存在时,可以消除SmLBD44对靶基因转录激活活性的抑制作用,提示SmLBD44可能参与了 JA信号通路介导的丹参次生代谢产物的调控过程。