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柑橘是世界第一大水果,我国的柑橘产量居世界首位,柑橘类水果的加工副产品主要是果汁和茶饮。由于在加工过程中柑橘所呈现的苦味问题影响了风味口感,这制约着我国柑橘加工业的发展。目前,学者对柑橘脱苦的方法主要集中在酶法脱苦上,与其他脱苦方法相比较,酶法脱苦有专一性强、效果好、成本低和营养成分不被破坏等优势,是最有应用前景的脱苦方法。
本文通过对多年生橘园的土壤和山西陈醋厂的醋醅样品进行富集培养,从中筛选得到3株较为高效降解柠檬苦素的菌株1、2、3号,进行形态学和分子生物学鉴定确定1号菌株为纤维菌属(Cellulomonas sp.),2号和3号菌株为苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.);对3号菌株建立响应面模型,优化3号菌株的发酵培养条件;研究3号菌株降解柠檬苦素的组学分析,为分子改造提高产酶活力提供理论依据。主要研究结果如下:
(1)对多年生橘园的土壤样品和发酵的醋醅进行富集培养后,通过平板筛选,得到8株能够以柠檬苦素为单一碳源生长的菌株,对菌株摇瓶复筛,得到3株降解能力较好的菌株,通过形态学和分子生物学,鉴定1号菌株为纤维菌属,2号和3号菌株为苍白杆菌属。
(2)对3株菌的培养条件做单因素试验,选择优势降解3号菌株构建响应面模型,发现3号菌株柠檬苦素降解率的最佳工艺为:pH为3.5,温度为30℃,氮源为硝酸铵,菌接种量为3×108CFU/mL。在此条件下,测得柠檬苦素降解率为78.90%,是优化前的2.1倍。
(3)通过IlluminaNovaSeq和PacbioSequel平台对3号菌株进行全基因组分析,发现该菌株总基因组长度为1,250,615,224bp,由两条环状的染色体和两条环状的质粒组成。通过IlluminaHiSeq测序平台进行转录组测序,并以全基因组为参考,分析表达差异基因主要涉及2,4-二烯酰辅酶A还原酶(NADPH)活性、内肽酶调节活性、催化活性的负调节、酶抑制剂活性、谷氨酸氨连接酶活性、3-甲基-2-氧代丁酸脱氢酶(2-甲基丙酰基转移)活性、氧化还原酶活性、丙酮酸-乙酰辅酶A活性、异柠檬酸裂解酶活性等生物学过程。表达差异基因主要涉及氧化磷酸化(ko00190)、丙酮酸代谢(ko00620)、丙酸酯代谢(ko00640)、精氨酸和脯氨酸代谢(ko00330)、乙醛酸和二羧酸酯的代谢(ko00630)等代谢途径。
(4)通过LC-MS技术分析代谢产物,发现代谢通路主要为柠檬酸盐循环(TCA循环)、柠檬烯的降解代谢、维生素代谢(烟酸酯和烟酰胺代谢、泛酸和CoA生物合成)、氨基酸代谢(丙氨酸,赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢)等代谢途径。
(5)对转录本和代谢物联合分析原核生物的固碳途径,推测可能存在二氧代戊二酸酯到异柠檬酸盐,再到柠檬酸盐代谢终产物的过程。
本文通过对多年生橘园的土壤和山西陈醋厂的醋醅样品进行富集培养,从中筛选得到3株较为高效降解柠檬苦素的菌株1、2、3号,进行形态学和分子生物学鉴定确定1号菌株为纤维菌属(Cellulomonas sp.),2号和3号菌株为苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.);对3号菌株建立响应面模型,优化3号菌株的发酵培养条件;研究3号菌株降解柠檬苦素的组学分析,为分子改造提高产酶活力提供理论依据。主要研究结果如下:
(1)对多年生橘园的土壤样品和发酵的醋醅进行富集培养后,通过平板筛选,得到8株能够以柠檬苦素为单一碳源生长的菌株,对菌株摇瓶复筛,得到3株降解能力较好的菌株,通过形态学和分子生物学,鉴定1号菌株为纤维菌属,2号和3号菌株为苍白杆菌属。
(2)对3株菌的培养条件做单因素试验,选择优势降解3号菌株构建响应面模型,发现3号菌株柠檬苦素降解率的最佳工艺为:pH为3.5,温度为30℃,氮源为硝酸铵,菌接种量为3×108CFU/mL。在此条件下,测得柠檬苦素降解率为78.90%,是优化前的2.1倍。
(3)通过IlluminaNovaSeq和PacbioSequel平台对3号菌株进行全基因组分析,发现该菌株总基因组长度为1,250,615,224bp,由两条环状的染色体和两条环状的质粒组成。通过IlluminaHiSeq测序平台进行转录组测序,并以全基因组为参考,分析表达差异基因主要涉及2,4-二烯酰辅酶A还原酶(NADPH)活性、内肽酶调节活性、催化活性的负调节、酶抑制剂活性、谷氨酸氨连接酶活性、3-甲基-2-氧代丁酸脱氢酶(2-甲基丙酰基转移)活性、氧化还原酶活性、丙酮酸-乙酰辅酶A活性、异柠檬酸裂解酶活性等生物学过程。表达差异基因主要涉及氧化磷酸化(ko00190)、丙酮酸代谢(ko00620)、丙酸酯代谢(ko00640)、精氨酸和脯氨酸代谢(ko00330)、乙醛酸和二羧酸酯的代谢(ko00630)等代谢途径。
(4)通过LC-MS技术分析代谢产物,发现代谢通路主要为柠檬酸盐循环(TCA循环)、柠檬烯的降解代谢、维生素代谢(烟酸酯和烟酰胺代谢、泛酸和CoA生物合成)、氨基酸代谢(丙氨酸,赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢)等代谢途径。
(5)对转录本和代谢物联合分析原核生物的固碳途径,推测可能存在二氧代戊二酸酯到异柠檬酸盐,再到柠檬酸盐代谢终产物的过程。