特异性结合BMP-2丝素支架的制备及其生物相容性研究

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骨形态发生蛋白2(BMP-2)是骨形态发生蛋白家族中的一员,具有极强的诱导成骨能力,属于转录生长因子β(TGF-β)超家族。通常,该类生长因子在体内的半衰期大约是数秒到数分钟,很容易失去活性。理想的方式是将生长因子与载体材料复合,保持生长因子在体内环境下的生物活性并实现其长期有效释放。而常规的物理吸附方法,存在BMP-2与载体间较低亲和性的问题,导致BMP-2的快速释放。近年来,研究者们尝试对BMP-2与载体的改性等方法来提高二者的亲和性。另一方面,丝素蛋白由于其良好的机械性能、生物相容性等被广泛应用于组织工程、药物释放等领域。本研究采用大肠杆菌BL21原核表达获得人重组BMP-2,系统地研究了人重组BMP-2原核表达纯化和复性,以及复性后蛋白的活性;采用冷冻干燥法制得丝素支架(SF),研究了二种特异性结合BMP-2丝素支架的制备方法,同时分析了其形貌、红外、孔隙率等因素,并考察了二种特异性结合BMP-2丝素支架肝素接枝量,以及对BMP-2吸附和释放行为;然后又分别研究了二种特异性结合支架细胞毒性,负载BMP-2后复合支架的生物相容性。通过原核表达所得到的BMP-2分子量在20kDa左右,与预期一致,在30μg/mL浓度下MG-63细胞的分化,具有良好的生物学活性。冷冻干燥法制得的丝素支架具有多孔结构,孔径分布在100-200μm,孔间连通性较好,红外结果显示其二种特异性结合支架中的SF蛋白结构转变成更加稳定的β折叠结合。HP/SF与HP/L-SF肝素接枝量分别达到了1.80±0.14μg/mg和1.10±0.22μg/mg。体外复合支架对BMP-2的吸附及释放行为研究结果表明,二种特异性结合BMP-2支架HP/SF与HP/L-SF能显著提高BMP-2的吸附量,相对于SF12.21±0.52μg BMP-2的吸附量,HP/SF的吸附量达到了15.15±0.93μg,而HP/L-SF的吸附量则更高,达到了19.65±1.81μg;并且二种支架在有效的抑制了BMP-2突释,相对于SF第一天50.41%的释放,HP/SF与HP/L-SF第一天的释放率分别下降到29.90%、26.82%,到达第七天时,相对于SF78.41%的释放率,HP/SF与HP/L-SF则分别为53.53%、40.97%;细胞结果表明,两种特异性结合BMP-2丝素支架负载BMP-2后均能持续显著地提高MG-63细胞分化水平,而且HP/L-SF组较HP/SF组有更高促进细胞分化的效果。本文针对BMP-2与载体间存在低亲和性,容易快速流失的缺点,采用在丝素支架接枝肝素,从而来提高与BMP-2的亲和性,并成功制备出了二种特异性结合BMP-2丝素支架,负载BMP-2后对MG-63细胞具有良好的生物相容性,是一种良好的BMP-2亲和载体。本研究工作为制备其它新型的BMP-2载体开拓了思路。
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