【摘 要】
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非编码RNA通过间接途径影响着遗传信息的表达,对其深入的研究有着重要的意义,本论文针对miRNA以及端粒RNA这两种重要的非编码RNA,分别对二者目前的重点研究方向设计不同的课题。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是近期发现的一类存在于真核生物体内的非编码RNA,其长度很短一般只由19至23个核苷酸组成,实验发现其具有多种调控功能。Mi RNA参与形成RNA沉默诱导复合体,不同于si R
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非编码RNA通过间接途径影响着遗传信息的表达,对其深入的研究有着重要的意义,本论文针对miRNA以及端粒RNA这两种重要的非编码RNA,分别对二者目前的重点研究方向设计不同的课题。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是近期发现的一类存在于真核生物体内的非编码RNA,其长度很短一般只由19至23个核苷酸组成,实验发现其具有多种调控功能。Mi RNA参与形成RNA沉默诱导复合体,不同于si RNA,具有抑制翻译但不对m RNA的完整性有影响的特点。Mi RNA与很多疾病和癌症相关,例如一些疾病中,经常会对应出现某些特定的异常表达的miRNA。快速准确的miRNA定量检测有助于对初期癌症患者癌症发展阶段的诊断,将其作为一种生物标记物来研究是很有意义的。端粒RNA是以亚端粒区域的DNA为模板通过RNA聚合酶转录得到非编码RNA,长度跨度很大约为0.1-9 kilobases,后来证实小到酵母细胞到斑马鱼、大至哺乳动物小鼠以及人类体内都含有端粒RNA序列,这种进化的高度保守性证明了其具有很重要的研究价值。端粒RNA在细胞内的功能虽然并没有被研究的很透彻,但部分生物学功能还是被逐步的发现,例如其可能通过形成DNA/RNA双链形成G-四链体参与调控染色体的重组以及调控端粒酶的活性。8-Oxoguanosine的氧化损伤是发生在RNA上最主要的一种氧化损伤,且这种损伤更易发生在富鸟嘌呤序列中,其氧化会影响G-四链体G平面的N7位的氢键配对,研究8-oxoguanosine的氧化损伤对以后端粒RNA序列的生物学功能研究有着重要的指导作用。本论文主要的研究方向之一就是通过构建脱氧核酶(DNAzyme)逻辑门来同时检测多种miRNA。脱氧核酶由于其结构简单、特异性高,可以设计用于扩增检测具有重要生物学意义的miRNA。因此,本论文构建了一系列的以miRNA作为信号输入分子,并基于DNAzyme结构上的变换的逻辑门。在构建的DNAzyme系统中进一步引入双链特异性核酸酶进一步放大输出信号,使得检出限达到了100 f M且具有良好的特异性。通过适当的设计,成功构建一系列的YES,NOT,AND以及INHIBIT逻辑门来实现同时扩增检测多种低含量miRNA,将miR-21,miR-122以及miR-let-7a这三种被研究比较广泛的在疾病中异常表达的miRNA应用于逻辑门,并进一步将本论文的方法应用于癌组织以及癌旁组织的实际样本的检测。本论文第二个研究课题是通过圆二色谱、Tm值测定、聚合酶延伸以及核磁共振氢谱研究8-oxoguanosine这种丰度较高的氧化损伤现象对人类端粒RNA G-四链体的结构及功能影响。通过圆二色谱的方法研究了8-oxoguanosine损伤发生在各个位点上对人类端粒G-四链体结构的影响。通过Tm值的测定研究了8-oxoguanosine损伤发生在各个位点上对人类端粒G-四链体稳定性的影响。通过多种聚合酶延伸的实验研究了8-oxoguanosine的错配能力。通过多种聚合酶应用于野生型端粒RNA序列及8-oxoguanosine修饰的端粒RNA序列的延伸研究了各序列阻碍延伸的效果。最后通过核磁共振氢谱研究G-四链体结构。
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