目的:新辅助化疗（NACT）在乳腺癌治疗中有着不可或缺的重要位置,个体间的病理反应差异明显。病理完全反应（pCR）可以作为NACT后长期无病生存的替代性预后标志物。其发生率仅为20-30%。然而,某些危险因素与化疗耐药的发生有关。因此,尽早预测NACT病理反应至关重要,有助于优化患者个体化治疗策略。肿瘤对NACT的反应是由肿瘤细胞和周围微环境间复杂的相互作用决定的。Ki-67是一种核抗原,被广泛用作细胞增殖的标记物。化疗前Ki-67被报道对NACT后病理反应有一定预测价值,然而,单一指标的预测价值仍存在争议。新生血管,作为肿瘤微环境中一个重要因素,被认为是乳腺癌进展的限速步骤,动态光学乳腺成像（DOBI）是一种利用近红外光检测生物组织微血管床相对血氧含量的非侵入无创影像技术。对乳腺癌NACT病理反应有良好的预测能力。但相关报道较少。细胞外基质作为肿瘤微环境中另一个重要因素,在NACT中也起着重要的作用。剪切波弹性成像（SWE）是一种非侵入性的超声成像方式,可量化体内的组织硬度。通过SWE定量的高基质肿瘤硬度与乳腺癌的化疗耐药密切相关,尽管还需要更多的研究报道。肿瘤硬度、光学血氧特征及Ki-67均是乳腺癌NACT后病理反应的早期预测因子。然而,至今还没有直接比较这些参数的预测诊断能力。最近研究表明,高基质硬度的肿瘤可以通过激活Twist家族BHLH转录因子1（TWIST-1）诱导上皮间质转化和肿瘤进展。TWIST-1过度表达与癌症患者生存期短及化疗耐药高度相关。低氧诱导因子1α（HIF-1α）介导细胞对缺氧的适应性,其表达也被报道与基质硬度高度相关。经HIF-1α激活缺氧信号通路可促进肿瘤放化疗后耐药的发生。此外,β1整合素（ITGB-1）在调节基质硬度中起着关键作用,ITGB-1的表达也被报道与乳腺癌化疗耐药和转移相关。以上研究大多数基于体外或动物模型的基础实验。然而,尚无研究调查乳腺癌患者中HIF-1α,TWIST-1和ITGB-1表达与肿瘤硬度之间的关系,以及这些生物标记物的预测性能。本研究拟执行以下三部分,第一部分,在临床患者中比较肿瘤大小、SWE肿瘤硬度、光学成像及Ki-67的预测价值。并探究这些指标结合后最佳预测诊断模式。第二部分,在临床患者中确定化疗前HIF-1α,TWIST-1和ITGB-1表达与肿瘤硬度,血氧含量和NACT病理反应的关系。同时,探讨新的预测因子HIF-1α,TWIST-1,ITGB-1单独或联合经典预测因子Ki-67的预测诊断价值。第三部分,建立裸鼠皮下成瘤模型,用透明质酸酶处理,降低肿瘤基质硬度,同时进行NACT治疗,在动物体内研究基质硬度降低对肿瘤组织局部血含氧量的影响,以及对关键通路蛋白HIF-1α,TWIST-1,ITGB-1,VEGF,CD31表达及NACT后病理反应性的影响,初步探讨乳腺癌肿瘤硬度可预测NACT病理反应性的潜在机制。研究方法:1、评价常规灰度超声、SWE和DOBI成像及传统预测因子Ki-67在乳腺癌NACT病理反应的预测效能 连续纳入2014年3月至2020年5月,在我院经粗针穿刺活检确诊为乳腺癌且符合入选条件的患者,在化疗前（t0）、每次化疗前（t0-t5）及最终手术前（t6）,分别应用灰度超声评估肿瘤大小（Size）;SWE评估肿瘤硬度（最大硬度（Emax）、平均硬度（Emean））;DOBI评估肿瘤血评分（BS）及氧评分（OS）;并计算一、二化疗周期后这些影像参数的相对变化率,记为 ΔSize（t1/t2）,ΔE（t1/t2）,ΔBS（t1/t2）及 ΔOS（t1/t2）。使用 NACT前穿刺活检标本,通过免疫组化定量评估Ki-67的表达。NACT后病理反应性采用残余肿瘤负荷（RCB）来评估。使用受试者工作特征曲线（ROC）和Z检验比较Size、SWE肿瘤硬度、BS、OS及Ki-67预测价值。最后,采用多变量线性回归模型,将具有最大的曲线下面积（AUC）的影像预测因子和传统预测因子Ki-67相结合,拟探究一种新的预测模型PredRCB1。评估其在总体及不同亚人群中的预测效能。2、评估HIF-1α,TWIST-1,ITGB-1与肿瘤硬度相关性和在乳腺癌NACT病理反应中的预测效能连续纳入2014年2月至2019年7月,在我院经粗针穿刺活检确诊为乳腺癌且符合纳入标准的患者,采用SWE和DOBI成像在NACT前一天对肿瘤硬度和OS进行评估;免疫组化对活检肿瘤标本进行HIF-1α、TWIST-1、ITGB-1和Ki-67定量评估。RCB评估NACT病理反应。比较不同病理反应组各项指标的差异,并检测HIF-1α、TWIST-1、ITGB-1、Ki-67与肿瘤硬度和OS的关系。通过ROC曲线评估HIF-1α、TWIST-1、ITGB-1和Ki-67的预测价值,最后,采用多变量线性回归模型将AUC最大的新预测因子（HIF-1α、TWIST-1及ITGB-1）和传统预测因子（Ki-67）相结合,拟探究一种新的预测模型PredRCB2。评估其在总体及亚人群中的预测效能。3、肿瘤基质硬度的改变对NACT病理反应性的影响和相关机制的初探体外培养三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞至对数生长期,收集细胞,建立皮下裸鼠乳腺癌移植瘤模型,裸鼠移植瘤模型随机分为4组（n=10）:对照组（等量的生理盐水）;透明质酸酶组（第0、3、6天给药）;NACT组（第1、4、7天给药）;联合干预组（第0、3、6天给透明质酸酶+第1、4、7天给化疗药）。每三天用游标卡尺测量并计算肿瘤体积。第0、3、6、9天,使用SWE及DOBI检测各组移植瘤的肿瘤硬度、BS及OS的变化情况。实验结束后,颈椎脱臼法处死裸鼠,对肿瘤组织进行免疫组化法和Western Blot法检测HIF-1α、TWIST-1、ITGB-1、VEGF及CD31的表达。结果:1、第一部分共纳入符合条件患者145例。（i）与其他参数相比,Δ Size（t2）、E2mean、ΔEmean（t2）、BS2、OS2 及 Ki-67 在预测病理反应良好（AUC=0.62,0.78,0.82,0.81,0.78,0.81）及耐药（AUC=0.64,0.80,0.85,0.79,0.78,0.84）中均显示了最佳的预测效能。Z检验表明,E2mean、ΔEmean（t2）、BS2、OS2及Ki-67的预测效能均高于Δ Size（t2）（P<0.05）,但这几个参数间无显著差异（P>0.05）。（ii）将ΔEmean（t2）,BS2及Ki-67相结合的全新的预测模型PredRCB1,其在病理反应良好（AUC=0.90）及耐药（AUC=0.93）中均有比单一参数更好的预测能力。（ⅲ）PredRCB1在不同亚组中均具有较好的预测能力。2、第二部分共纳入符合条件患者104例。（ⅰ）肿瘤硬度与OS呈负相关,与 HIF-1α,TWIST-1,ITGB-1 的表达呈正相关。（ⅱ）HIF-1α,TWIST-1,ITGB-1 和 Ki-67 在病理反应良好（AUC=0.81,0.85,0.79,0.80）及耐药（AUC=0.83,0.86,0.84,0.85）中显示出很好且相似的预测能力。（ⅲ）将预测效能最高的TWIST-1与Ki-67相结合后,新预测模型PredRCB2展现了比单一指标更好的预测效能（反应良好,AUC=0.88;耐药,AUC=0.92）。（ⅲⅰ）PredRCB2在不同亚组中均有较好的预测能力。3、第三部分成功制备乳腺癌皮下成瘤裸鼠模型;同时发现透明质酸酶可显著降低肿瘤基质硬度;减少肿瘤基质硬度可提高含氧量,并抑制HIF-1α,TWIST-1,ITGB-1,VEGF及CD31蛋白的表达,同时提高肿瘤对化疗的敏感性。结论:首先,从影像学角度,SWE肿瘤硬度,光学血氧参数,Ki-67具有优异和相似的总体预测能力,且明显高于常规参数Size。将Ki-67,肿瘤硬度和BS相结合得到全新预测模型PredRCB1,比单一指标预测效能更好。其次,从分子生物学角度,首次在临床患者中,证实肿瘤硬度、OS、HIF-1α、TWIST-1和ITGB-1的相关性。其次,化疗前HIF-1α、TWIST-1和ITGB-1具有非常好的预测能力。将TWIST-1与Ki-67相结合得到全新预测模型PredRCB2,比单一指标预测效能更好。PredRCB1及PredRCB2在总体和亚人群中均展现出优异的早期预测效能,有助于患者制定个体化治疗方案。最后,通过降解透明质酸方式降低裸鼠移植瘤肿瘤硬度,HIF-1α、TWIST-1、ITGB-1、VEGF及CD31的表达降低,肿瘤对化疗的敏感性增加。在动物模型中进一步证实了肿瘤硬度,乏氧与化疗耐药的关系。可为全新工作假说“高基质肿瘤硬度-乏氧-HIF-1α/TWIST-1/ITGB-1通路诱导乳腺癌化疗耐药。”提供一部分先驱试验依据。