研究背景胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤,其中星形胶质细胞瘤是最常见的组织学类型,其发生率占所有胶质瘤的75%以上。根据2007年WHO颅内肿瘤的病理分级标准,星形胶质细胞共分为四级(Ⅰ级-Ⅳ级)。胶质母细胞瘤(Ⅳ级)是发生率及恶性程度最高的星形胶质细胞瘤。尽管显微手术切除、术后放疗、化疗等综合治疗措施的广泛应用,胶质母细胞瘤患者的预后仍旧很差,其中位生存期不足一年。随着分子生物学的发展,以肿瘤特异性表达基因谱为基础的分子靶向治疗有可能为胶质瘤的治疗带来新希望。因此,确定与胶质瘤恶性进展相关并具有预后意义的分子对于实施有效的靶向治疗具有重要意义。星形胶质细胞瘤,特别是胶质母细胞瘤,以高度的细胞分裂活性,明显的微血管增生,及广泛的浸润生长为特征。生长因子的超表达在这些病理改变中起了非常重要的作用,如已知的血管生成因子(VEGF),肝细胞生长因子(HCG),以及血小板衍生因子(PDGF)等等。PGRN (progranulin)即颗粒蛋白前体,又称为颗粒素-上皮素前体,鼠畸胎瘤PC细胞源性生长因子,是新近发现的一种多功能的生长因子,它持续高水平表达于组织的塑型与重构过程,如胚胎的发育,伤口的修复,炎症以及肿瘤组织的形成等等。以前的研究发现PGRN与肿瘤的发生发展密切相关,例如它可加速细胞的增殖,抑制细胞的凋亡,促进细胞的迁移、侵袭行为等等。这些作用与它能够激活PI3K/AKt、MAPK/ERK、FAK等生长因子相关通路有关。迄今为止,在多种肿瘤组织如卵巢癌、前列腺癌、肝癌、骨髓瘤等均发现了PGRN的高水平表达。有研究发现,PGRN基因在胶质母细胞瘤中的表达水平比正常脑组织显著升高。然而PGRN在各级星形胶质细胞瘤中的表达状态、临床意义、以及与肿瘤侵袭性的关系仍未见报道。本研究旨在明确PGRN在星形胶质细胞瘤中的表达情况及其临床意义,并对PGRN与胶质母细胞瘤侵袭性的关系进行初步探讨。目的1. PGRN在星形胶质细胞瘤临床标本及胶质母细胞瘤细胞系中的表达情况2.探讨PGRN的表达与星形胶质细胞瘤临床病理特征的关系及预后意义3.沉默PGRN的表达对胶质母细胞瘤细胞系U87、T98G细胞增殖的影响4.沉默PGRN的表达对胶质母细胞瘤细胞系U87、T98G细胞侵袭性的影响及分子机制方法1.PGRN在星形胶质细胞瘤临床标本及胶质母细胞瘤细胞系中的表达①临床标本收集：收集山东大学齐鲁医院神经外科2005-2009年间新鲜手术标本56例以及病理科石蜡包埋标本154例。所有患者术前未行放疗或化疗治疗。②采用RT-PCR、Western Blot及免疫组化的方法检测临床标本和胶质瘤细胞系U87、U251及T98G中PGRN的表达情况。2. PGRN在星形胶质细胞瘤标本中表达的临床意义①方差分析(ANOVA)比较PGRN在各病理级别星形胶质细胞瘤之间的表达差异；卡方检验分析PGRN的表达与星形胶质细胞瘤临床特征之间的关系；Kaplan-Meier生存曲线及Cox多因素回归分析确定PGRN的表达与星形胶质细胞瘤患者预后间的关系。3.沉默PGRN的表达对胶质母细胞瘤增殖的影响①设计合成PGRN特异性siRNA,在脂质体LipofectamineTM2000介导下转入胶质母细胞瘤细胞系U87和T98G内,转染48小时后在mRNA及蛋白质水平检测PGRN的表达。②采用CCK-8法分析PGRN siRNA在不同时间点对肿瘤细胞活性的影响,绘制生长曲线。③CCK-8法分析PGRN siRNA转染后的U87和T98G细胞对化学药物冬凌草甲素敏感性的变化。4. PGRN影响胶质母细胞瘤细胞侵袭性的影响及分子机制①Transwell法检测沉默PGRN的表达对U87和T98G细胞侵袭能力的影响。②RT-PCR和Western Blot法检测PGRN siRNA转染后侵袭性相关基因MMP-2、 MMP-7与MMP-9的变化。③明胶酶谱法检测PGRN siRNA转染后胶质母细胞瘤细胞培养上清中MMP-2与MMP-9酶活性的变化。结果1. PGRN在星形胶质细胞瘤临床标本及胶质母细胞瘤细胞系中的表达①PGRN在人胶质母细胞瘤细胞系中表达应用RT-PCR及Western Blot方法检测胶质母细胞瘤细胞系U87、U251及T98G中PGRN的表达,结果显示三种细胞系中均存在明显的PGRN表达。②PGRN在星形胶质细胞瘤临床标本中表达为进一步研究PGRN在胶质瘤中的作用,我们首先采用RT-PCR及Western Blot的方法检测35例新鲜星形胶质细胞瘤手术标本中PGRN的表达,5例正常对照脑组织标本来自脑外伤行内减压的患者。RT-PCR结果显示：PGRN mRNA在肿瘤组织的表达率为97.1%(34/35),5例正常脑组织未检测到PGRN的表达。Western Blot结果显示PGRN在肿瘤组织的表达率为100%,而仅有2例正常脑组织检测到极微弱的PGRN表达。为进一步确定PGRN的表达状态,我们采用免疫组化的方法检测PGRN在210例星形胶质细胞瘤石蜡标本中的表达。与Western Blot的结果相似,正常脑组织显示阴性染色或仅有零星的神经细胞胞体中存在弱阳性染色,而高达96.7%(203/210)的肿瘤切片中存在PGRN的阳性染色。PGRN的阳性染色不仅见于肿瘤细胞,而且也见与肿瘤相关的血管内皮细胞。这种状况在胶质母细胞瘤最为明显,51.1%的胶质母细胞瘤标本存在血管的PGRN强阳性表达。2.PGRN在星形胶质细胞瘤标本中表达的临床意义为阐明PGRN在星形胶质细胞瘤发生、发展中的作用。我们分析了PGRN的表达与星形胶质细胞瘤临床特征间的关系。结果显示PGRN的表达与星形胶质细胞瘤患者的年龄、性别、肿瘤位置、KPS评分无明显相关性。方差分析显示无论是肿瘤细胞的PGRN表达评分,还是血管内皮细胞的PGRN表达评分均随病理级别的升高而增高。通过Kaplan-Meier生存曲线分析和生存率分布Log-rank检验发现,PGRN低表达的胶质母细胞瘤患者预后明显好于高表达的患者(P<0.001)。进一步的COX多因素回归分析发现PGRN的表达以及PGRN在血管内皮细胞的表达对于胶质母细胞瘤患者的生存均是独立的预后因素(相对危险系数,2.506,95%可信区间,1.511-4.155,P=0.000；相对危险系数,1.667,95%可信区间,1.112-2.498,P=0.013)。这说明PGRN的低表达能改善胶质母细胞瘤患者的预后,延长患者生存时间。3.沉默PGRN的表达对胶质母细胞瘤增殖的影响为进一步确定PGRN在胶质母细胞瘤中的作用,我们通过siRNA技术沉默PGRN在胶质母细胞瘤中的表达,观察它对肿瘤细胞增殖的影响。①PGRN特异性siRNA可有效抑制PGRN的表达设计合成PGRN siRNA片段,在脂质体的介导下转入U87与T98G细胞内。RT-PCR与Western Blot检测沉默效果,结果显示特异性PGRN siRNA可有效抑制PGRN的表达。②PGRN沉默表达抑制胶质母细胞瘤细胞生长对U87与T98G细胞转染特异性PGRN siRNA48小时后,CCK-8法检测细胞活力,绘制生长曲线。结果显示细胞生长受到明显抑制。③PGRN沉默表达增加胶质母细胞瘤细胞对冬凌草甲素的敏感性将PGRN siRNA转入U87及T98G肿瘤细胞,48小时后加入不同浓度的冬凌草甲素,作用48小时后CCK-8法检测细胞存活率。结果显示,沉默PGRN的表达增加肿瘤细胞对冬凌草甲素的敏感性。4. PGRN影响胶质母细胞瘤细胞侵袭性的影响及分子机制①PGRN沉默表达抑制胶质母细胞瘤的侵袭能力应用Transwell的方法检测细胞的侵袭功能。与对照组相比,PGRN siRNA转染后U87与T98G细胞的侵袭能力明显下降。②PGRN沉默表达抑制胶质母细胞瘤MMP-9的表达PGRN siRNA处理U87与T98G细胞后,RT-PCR检测侵袭性相关基因的变化。结果发现在MMP-2/-7/-9中只有MMP-9出现转录水平降低。Western Blot检测进一步确定了MMP-9在蛋白水平的降低。PGRN siRNA处理U87与T98G细胞48小时后,取细胞培养上清,通过明胶酶谱法检测MMP-2/-9的酶活性。结果显示MMP-9酶活性下降,进一步从分泌水平确定了PGRN对MMP-9的影响。结论1.在星形胶质细胞瘤临床标本及细胞系中存在PGRN的表达。2.PGRN在星形胶质细胞瘤临床标本中的表达水平与肿瘤的病理级别正相关。3.在胶质母细胞瘤中,PGRN的高水平表达预示着患者的预后不良。4.COX多因素回归分析显示PGRN的表达是胶质母细胞瘤患者生存的独立预后因素。5.沉默PGRN的表达可抑制胶质母细胞瘤细胞系U87与T98G的生长。6.沉默PGRN的表达可增加胶质母细胞瘤细胞系U87与T98G对冬凌草甲素的敏感性。7.沉默PGRN的表达可以抑制胶质母细胞瘤细胞系U87与T98G的侵袭。8.沉默PGRN的表达可以抑制胶质母细胞瘤细胞系U87与T98G中MMP-9的表达。背景与目的胶质母细胞瘤是最常见、恶性程度最高的颅内原发性肿瘤。尽管显微手术技术与辅助治疗措施有了显著进步,但胶质母细胞瘤患者的中位生存期仍只有12-15个月。肿瘤细胞对正常脑组织的广泛浸润是造成病人致残或死亡的主要原因,而且这些侵入正常脑组织中的肿瘤细胞对放、化疗有着极强的抵抗性。因此,确定与胶质母细胞瘤的侵袭性相关的特定分子对于制定有效的靶基因治疗十分必要。CIP2A是最近发现的一个癌基因,它可以抑制蛋白磷酸酶2A对转录因子c-Myc的降解,而c-Myc是一个重要的癌基因蛋白,它在多种肿瘤的发生发展中发挥着关键作用。研究显示,CIP2A广泛表达于乳腺癌、舌癌、肿癌、卵巢癌、子宫颈癌以及肾细胞癌等多种人类肿瘤,而且它的表达与肿瘤的恶性潜能及预后密切相关。然而,CIP2A在胶质母细胞瘤中的作用目前仍未明确。因此,本研究的目的：(1)检测CIP2A在胶质母细胞瘤中的表达状态及其意义。(2)探讨C工P2A的表达与胶质母细胞瘤侵袭性的关系。方法1.CIP2A在胶质母细胞瘤中的表达情况及其临床病理意义①肿瘤标本及临床资料的收集：收集山东大学齐鲁医院神经外科2006-2010年间胶质母细胞瘤手术标本79例,其中包括新鲜手术标本16例。7例正常脑组织标本作为对照。回顾患者术前的MRI资料,根据MRI的表现,将胶质母细胞瘤分为单一病灶型、弥散浸润型与多中心病灶型三类。②RT-PCR与Western Blot检测临床标本中CIP2A的表达情况。免疫组化的方法检测CIP2A蛋白、Ki-67、MMP-9及EGFR蛋白在胶质母细胞瘤组织中的表达情况。③卡方检验CIP2A与术前MRI表型、Ki-67生长指数、MMP-9蛋白表达、EGFR表达、以及其它临床特点之间的关系。Kaplan-Meier生存曲线及Cox多因素回归分析确定CIP2A的表达与患者预后之间的关系2.沉默CIP2A的表达对胶质母细胞瘤迁移与侵袭功能的影响①在脂质体LipofectamineTM2000的介导下,将CIP2A特异性siRNA转入胶质母细胞瘤细胞系U87和T98G内,转染48小时后在mRNA及蛋白质水平检测CIP2A的表达。②划痕修复实验与Transwell法检测CIP2A沉默后胶质母细胞瘤迁移与侵袭能力的变化。结果1. CIP2A在胶质母细胞瘤中的表达情况及其临床意义①CIP2A在胶质母细胞瘤临床标本中高表达采用RT-PCR、Western Blot的方法检测16例胶质母细胞瘤与7例正常脑组织标本中CIP2A的表达,结果显示肿瘤组织高水平表达CIP2A。CIP2A mRNA在肿瘤组织的表达率为87.5%(14/16),而在正常脑组织为28.6%(2/7)。Western Blot结果显示11例(68.8%)肿瘤组织有明显的CIP2A蛋白表达,而在71.4%(5/7)的正常脑组织未检测到CIP2A蛋白。应用免疫组化的方法检测79例石蜡切片中CIP2A的表达情况,结果显示CIP2A染色主要位于细胞胞浆,偶见于细胞核中。77.2%(61/79)的标本CIP2A染色阳性,其中13例高表达。②CIP2A的表达与胶质母细胞瘤临床病理特征的关系为阐明CIP2A在胶质母细胞瘤的发展,尤其是在其侵袭性中的作用,我们分析了CIP2A的表达与肿瘤的临床病理特征之间的关系。结果显示CIP2A高表达的肿瘤在MRI上往往表现为弥散浸润型与多中心病灶型(P=0.000)。进一步分析发现CIP2A高表达与MMP-9及EGFR的高表达显著相关(P=0.004与P=0.001),而CIP2A高表达与Ki-67的高表达关系并不显著(P=0.519)。以上结果显示CIP2A的表达与肿瘤侵袭性明显相关。③CIP2A表达与胶质母细胞瘤患者预后的关系通过Kaplan-Meier生存曲线分析和生存率分布Log-rank检验发现,在胶质母细胞瘤中,CIP2A低表达的肿瘤患者预后明显好于高表达的患者(P=0.000)。进一步的COX多因素回归分析发现CIP2A的表达对于胶质母细胞瘤患者的生存均是独立的预后因素(相对危险系数,2.139,95%可信区间,1.082-4.228,P=0.029)。2.沉默CIP2A的表达对胶质母细胞瘤迁移与侵袭功能的影响①CIP2A特异性siRNA可有效沉默CIP2A的表达设计合成PGRN siRNA片段,在脂质体的介导下转入U87与T98G细胞内。RT-PCR与Western Blot检测沉默效果,结果显示特异性CIP2AsiRNA可有效沉默PGRN的表达。②PGRN沉默表达抑制胶质母细胞瘤的迁移与侵袭能力用损伤修复试验测定胶质母细胞瘤的迁移能力,与对照组相比,CIP2A siRNA转染后U87与T98G细胞的迁移能力明显下降。Transwell试验用来测定CIP2A siRNA转染后细胞的侵袭能力,结果显示转染后胶质瘤细胞的侵袭能力显著下降。结论1.CIP2A在胶质母细胞瘤中高水平表达,而且CIP2A的高表达与患者的不良预后有着显著相关性,它是胶质母细胞瘤患者预后的独立预测因素。2.CIP2A的高水平表达与代表肿瘤高侵袭性的临床病理特征明显相关。3.抑制CIP2A在胶质母细胞瘤中的表达可以引起肿瘤细胞迁移与侵袭能力的下降。