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研究背景:氧化应激是引起皮肤衰老的重要原因之一,无论是内在因素还是外在因素引起的皮肤衰老都与氧化应激对皮肤细胞造成损伤密切相关。除了一般的自由基,一些研究也报道了非酶反应诱导的脂质活性自由基参与了皮肤衰老的过程。近年来,随着新型细胞死亡方式Ferroptosis的发现,酶介导的特异性脂质过氧化开始引起了研究者的关注,这种脂质过氧化类型与非酶介导的脂质过氧化在形式和过程上截然不同,在机体生理和病理过程中发挥重要作用。然而,酶介导的特异性脂质过氧化尤其是磷脂的氧化能否及如何参与皮肤细胞衰老的过程尚不清楚。谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4,GPX4）是唯一能够直接靶向清除生物膜上脂质活性氧自由基的酶,其缺失能引起脂质过氧化物的堆积,破坏细胞的正常结构和功能。因此,本课题将研究和探讨GPX4及其缺失介导的脂质过氧化在皮肤衰老中的作用及机制,旨在揭示皮肤衰老的发生机制,为防治皮肤衰老及其相关疾病提供新的作用靶点。研究方法与结果:首先,我们在不同年龄人眼部皮肤、不同月龄小鼠皮肤、紫外照射小鼠皮肤中检测衰老相关指标、脂质过氧化水平及GPX4表达。（1）收集正常人眼部皮肤组织,并根据年龄将其分为年轻成人皮肤及年长成人皮肤。Sirius Red及Masson染色结果均显示年长成人皮肤组织出现明显的胶原流失;Western blot结果发现,年长成人皮肤组织中衰老相关蛋白p53蛋白磷酸化水平且p21蛋白水平均上调,脂质过氧化产物4-HNE水平增加;q RT-PCR、Western blot及免疫荧光结果显示,年长成人皮肤中的GPX4的表达明显下调。（2）收集年轻及年长小鼠背部皮肤组织,进行H&E、Sirius Red及Masson染色。结果显示,年长的小鼠真皮层显著变薄,且胶原纤维发生明显流失;衰老相关β半乳糖苷酶（Senescence associatedβ-galactosidase,SAβ-Gal）染色结果显示,年长小鼠皮肤组织中SAβ-Gal阳性表达明显增多;Western blot结果显示,年长小鼠皮肤组织中衰老相关蛋白p53蛋白磷酸化水平增加,p21蛋白表达上调。进一步,我们分别采用LC-MS、试剂盒及Western blot检测皮肤组织中GSH、MDA、4-HNE的水平。结果显示,年长小鼠皮肤GSH含量显著下降,脂质过氧化产物MDA及4-HNE水平显著增加,采用q RT-PCR、Western blot及免疫荧光技术检测小鼠皮肤中的GPX4的表达,结果显示,年长小鼠皮肤GPX4表达显著下降。以上结果说明,随着月龄增长,小鼠皮肤出现衰老表型,且脂质过氧化显著增加及GPX4明显下调。（3）使用紫外照射建立小鼠皮肤光老化模型,并在该模型上检测了皮肤脂质过氧化水平及GPX4表达。实验结果显示,紫外照射小鼠皮肤SAβ-Gal表达增加,皮肤组织中胶原纤维流失、脂质过氧化水平上升,且皮肤组织中的GPX4含量下降。以上三种人及动物衰老模型的结果均显示衰老皮肤组织中存在明显的脂质过氧化,且伴随GPX4表达下调,初步提示GPX4可能参与了衰老皮肤中脂质过氧化的累积。其次,我们在人真皮成纤维细胞（Human dermal fibroblast,HDFs）中采用GPX4特异性抑制剂RSL3和GPX4敲低进行实验,进一步探讨GPX4在皮肤衰老中的作用。（1）通过形态学观察发现RSL3处理后,细胞形态变大且扁平。细胞生长曲线实验结果显示,RSL3能够抑制HDFs细胞的生长速率。进一步采用Ed U标记实验对细胞增殖能力进行检测,结果显示RSL3能够减少Ed U的阳性细胞数,确证了RSL3对HDFs细胞的生长抑制作用。随后,我们采用SAβ-Gal染色及免疫荧光技术检测衰老的指标,结果发现RSL3显著增加了SAβ-Gal阳性细胞率,促进衰老相关异染色质位点（Senescence-associated heterochromatin foci,SAHF）的形成。（2）采用si RNA对HDFs细胞GPX4进行敲低,我们发现GPX4低表达细胞同样出现增殖能力下降、SAβ-Gal阳性细胞率增加及SAHF形成增加等衰老表型,说明GPX4敲低能诱导细胞发生衰老。以上体外实验结果表明,GPX4缺失能够诱导HDFs发生衰老。最后,我们探讨了GPX4缺失诱发的脂质过氧化是否参与了细胞衰老及其调控机制。采用免疫荧光技术及流式细胞术检测细胞脂质过氧化水平,结果显示RSL3显著增加HDFs细胞中氧化型C11-BODIPY水平及氧化脂质特异性标记Liperfluo水平。同样,GPX4敲低也能增加氧化型C11-BODIPY水平。LC-MS脂质组学分析结果显示,RSL3显著增加细胞的氧化磷脂ox-PE与ox-PC含量。此外,在H2O2诱导的皮肤细胞衰老模型中,我们并未检测到明显的脂质过氧化。我们还发现脂质过氧化特异性清除剂Ferrostatin-1（Fer-1）显著抑制了RSL3诱导的细胞衰老及脂质过氧化水平,而普通自由基清除剂NAC没有显示同样的作用效果。以上实验数据说明了GPX4缺失引发了特异性脂质过氧化,而不是通过产生一般的ROS,诱导细胞发生衰老。进一步,我们采用免疫荧光技术检测DNA损伤标记物γ-H2AX的表达,并采用Western blot检测Chk-1磷酸化水平及p53-p21衰老相关通路蛋白的表达。结果显示,RSL3处理后细胞没有发生明显的DNA损伤,但是p53蛋白磷酸化水平及下游蛋白p21蛋白表达明显上调,这一变化被Fer-1有效逆转,表明GPX4缺失介导的脂质过氧化激活了p53-p21衰老相关通路。研究表明,PML核小体（Promyelocytic leukemia-nuclear bodies,PML NBs）在细胞衰老及调控p53中发挥重要的作用。因此,我们采用免疫荧光、Western blot及q RT-PCR技术检测PML的表达及PML NBs的形成。实验结果发现,RSL3处理或者GPX4敲低均能显著增加PML的表达水平、促进PML NBs的形成,而Fer-1能抑制RSL3处理后细胞PML NBs的形成。我们还发现,PML敲低后,RSL3不能诱导细胞发生衰老。以上结果说明,GPX4缺失介导的脂质过氧化促进了PML蛋白的表达,同时促进了其在核内形成PML NBs,激活p53-p21通路引发细胞衰老。同时,我们在体内水平也发现了RSL3能够促进小鼠皮肤衰老,更充分地证明了GPX4在皮肤衰老中的作用。研究结论:本课题采用不同体内衰老模型,证明了皮肤衰老与脂质过氧化累积、GPX4低表达存在相关性。在皮肤细胞中特异性抑制或敲低GPX4后,我们发现GPX4缺失介导的脂质过氧化诱发皮肤细胞衰老的机制与PML NBs引起p53-p21通路的激活有关。