论文部分内容阅读
生物胺形成是酸鱼重要的安全隐患,肠细菌是非常重要的产生物胺菌,其分泌多种氨基酸脱羧酶脱羧对应氨基酸产生相应的生物胺。目前国内外对鲜鱼中产胺微生物研究较多,但对于发酵鱼制品中发酵过程中产胺微生物研究较少。本研究通过聚合酶链氏反应(PCR)对中国传统发酵酸鱼中肠细菌进行氨基酸脱羧酶基因多样性检测,利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测生物胺含量;研究了pH对肠细菌产生物胺类型和能力的影响,以及酸胁迫下各产胺途径的关系;研究K.aerogenes 10C2组氨酸脱羧酶的酶学性质;研究K.aerogenes10C2组氨酸脱羧酶基因克隆和生物信息学分析。具体内容及结果如下:(1)本研究测定了酸鱼中97株肠细菌的生物胺形成能力。研究结果表明,97株菌产大量腐胺、尸胺、组胺。将97株菌按产生物胺能力的强弱分为4个等级,大肠菌产腐胺最多,其次是组胺、尸胺。在产腐胺方面,产腐胺含量大于900 mg/l的占33.0%(32/97),产腐胺含量大于500 mg/l的占81.4%(79/97)。产组胺含量在100-500 mg/L之间占41.2%(40/97)。然而,没有一个产尸胺大于500 mg/L的,产尸胺含量在100-500 mg/L的占16.5%(16/97),低于100 mg/L的占83.5%(81/97)。对27株菌的16S rDNA序列比对,比对结果得2株Enterobacter asburiae,2株Klebsiella aerogenes,3株Klebsiella oxytoca,1株Klebsiella pneumoniae,5株Enterobacter hormaechei,3株Enterobacter ludwigii,7株Morganella morganii,1株Citrobacter youngae,2株Enterobacter cloacae,1株Enterobacter sp。检测了27株高产生物胺的氨基酸脱羧酶基因型27株菌携带odc、speA、speB、adiA和ldc基因,13株携带hdc基因。(2)不同pH对27株菌产胺类型及能力影响。研究结果表明,pH显著影响了产胺菌的产胺类型和能力。odc、adiA、spe B、ldc、和hdc在细胞抵抗酸胁迫中扮演重要角色,各产胺途径相互协作抵抗酸环境。在pH 6.70,pH 6.00时大部分肠细菌以产腐胺、尸胺、组胺去调节细胞外酸环境以适应生长;在pH 5.00,pH 4.50时产腐胺和尸胺为主去调节细胞外酸环境以适应生长,也有少部分菌以腐胺和组胺为主去调节细胞外酸环境。酸胁迫会造成微生物生长滞后但是会增加腐胺、组胺、尸胺的含量。氨基酸脱羧酶具有菌株特异性而不是菌种特异性。(3)研究了K.aerogenes 10C2组氨酸脱羧酶酶学性质。该组氨酸脱羧酶最适温度是45℃,最适pH是6.00,保持组氨酸脱羧酶高酶活性热稳定性范围在4-30℃,pH稳定性范围是p H 5.00-8.00。Mg2+可以提高该菌的组氨酸脱羧酶活,相对酶活106%,Ca2+、Mn2+、K+、Pb2+对该酶的酶活基本没有影响,Fe2+、Fe3+降低了部分酶活性,但酶活性仍然保持在89%以上。而Zn2+、Cu2+极大地抑制了酶活性,剩余相对酶活分别为28%、1%。(4)基因克隆和生物信息学分析。编码该酶的核酸序列长度为1137 bp,蛋白质大小约为44 KDa。该酶位于细胞质,分子式为C1905H2914N510O558S17,分子质量为42434.20,该蛋白等电点理论值为5.86<7.0,因此该蛋白为酸性蛋白,脂肪系数是84.68。总平均亲水性为-0.176<0,由此可知该蛋白易溶,具有较强的亲水性。该酶由378个氨基酸组成的,包含了20中氨基酸。其中丙氨酸(Ala)、异亮氨酸(Ile)在该组氨酸脱羧酶的编码氨基酸中使用最多,均占氨基酸总数的8.7%,其次是丝氨酸(Ser)7.7%,天冬氨酸(Asp)7.4%。吡咯赖氨酸(Pyl)、硒代半胱氨酸(Sec)这两种特殊的氨基酸不被包含在内。该酶有11个激酶磷酸化位点、无信号肽、无跨膜结构。二级结构预测可知,该蛋白主要包含有Alpha helix(Hh)α-螺旋、Extended strand(Ee)延伸链、Beta turn(Tt)β-转角、Random coil(Cc)无规则卷曲。α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲结构贯穿整个氨基酸链,且均衡分布。其中最多的是α-螺旋(Hh)和无规则卷曲结构(Cc),Hh有151个氨基酸,占39.95%,Cc有150个氨基酸,占39.68%。其次是延伸链(Ee),有59个氨基酸,占15.61%。最少的是β-转角(Tt),只有18个氨基酸,占4.76%。