【摘 要】
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体外培养在含高浓度KCI([KCI]o=25 mM,25 K)培养基的小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons,CGNs)很好模拟了在小脑发育过程CGNs发生去极化并迁移分化成熟的现象。高浓
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体外培养在含高浓度KCI([KCI]o=25 mM,25 K)培养基的小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons,CGNs)很好模拟了在小脑发育过程CGNs发生去极化并迁移分化成熟的现象。高浓度KCI(25 K)模拟了体内的“电活性”,使CGN处于去极化状态,从而维持CGNs存活并促使其分化成熟。我们发现去极化(25K)时糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)活性被抑制并介导了神经元存活,但具体机制仍不清楚。这里,我们的研究发现GSK-3β活性的抑制能被L-型钙通道拮抗剂nifedipine及calmodulin(CaM)抑制剂W-13恢复,表明去极化时Ca2+/CaM介导了GSK-3β活性的抑制。我们通过抑制剂实验及体外激酶反应证实Ca2+/CaM激活下游激酶CaMKⅡ,CaMKⅡ磷酸化GSK-3β关键的抑制性磷酸化位点Ser9。但CaMKⅡ抑制剂CaMKⅡNtide抑制GSK-3βSer9的磷酸化后并不能完全恢复GSK-3β活性；进一步,我们的双向电泳及免疫耗竭实验表明去极化时有一部分(约65％)GSK-3β并不受Ser9磷酸化调控,以上结果提示其它方式参与了去极化对GSK-3β活性的调控。在这里,我们发现Ca2+/CaM可直接与GSK-3β相互作用,CaM—S4B pull down及免疫共沉淀实验都证实GSK-3β与CaM呈钙依赖相互作用；通过GSK-3β续减分析,我们确定GSK-3β的60-120位氨基酸是与CaM结合的关键区域,去除这一段后GSK-3β与CaM的结合明显减弱。此外,我们通过双分子荧光互补分析(Bimolecular FluorescenceComplementation assay,BiFC)观察到GSK-3β与CaM在细胞内形成BiFC信号,去除两者相互作用区域化后BiFC信号明显减弱,证实GSK-3β与CaM能在细胞内相互作用。
最后,激酶反应结果表明CaM能呈浓度依赖性抑制GSK-3β活性。因此,我们的研究论文阐明了去极化调控GSK-3β活性具体机制,即Ca2+/CaM通过激活CaMKⅡ磷酸化Ser9及通过直接结合抑制GSK-3β活性。GSK-3β调控新机制的揭示为解释去极化在维持不同类型神经元分化、迁移等发育过程中的作用提供了理论参考；为探讨GSK-3β精确调控机制及在疾病治疗中的作用提供了新的方向。
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